釀酒酵母高效自主復制區的篩選與鑒定

沈方琳, 黃雙成，侯朋晨，耿安麗, 阮文權*

1(江南大學 環境與土木工程學院，江蘇 無錫，214122) 2(義安理工學院，生命科學與化學技術實驗室，新加坡) 3(江蘇省厭氧生物技術重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

釀酒酵母高效自主復制區的篩選與鑒定

沈方琳1,3, 黃雙成2，侯朋晨2，耿安麗2, 阮文權1,3*

1(江南大學 環境與土木工程學院，江蘇 無錫，214122) 2(義安理工學院，生命科學與化學技術實驗室，新加坡) 3(江蘇省厭氧生物技術重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

在酵母表達過程中，傳統的表達載體存在著拷貝數低以及穩定性差的缺點。因此，找到一個可用于構建復制整合型載體的高效酵母自動復制區(Autonomously Replicating Sequence，ARS)是解決問題的關鍵。研究中，從釀酒酵母基因組中擴增得到4種不同的ARS(ARS304、ARS315、ARS735、ARS1512), 然后連接到整合載體pNTS2K中，得到4種復制整合型載體(pNTS2K-ARS304、pNTS2K-ARS315、 pNTS2K-ARS735、pNTS2K-ARS1512)。經電轉化后，4種轉化子(36a(pNTS2K-ARS304)、36a(pNTS2K-ARS315)、36a(pNTS2K-ARS735)、36a(pNTS2K-ARS1512))都能在含有300 μg/mL G418的YPD平板上生長。然而，只有轉化子36a(pNTS2K-ARS315)能在含有500 μg/mL G418的YPD液體培養基里較快生長。經過G418耐受性檢測后，36a(pNTS2K-ARS315)仍能在含有1 mg/mL G418的YPD培養基中很好地生長。此外，通過質粒pNTS2K-ARS315表達熒光蛋白，其表達效果高于普通商業質粒。實驗結果證明，4種復制區都能在釀酒酵母中獨立自主復制，其中ARS315復制能力最強。因此，ARS315可用于構建高拷貝且穩定的重組質粒，為構建高表達且穩定的工程酵母菌株奠定了基礎。

釀酒酵母；自動復制區；高拷貝復制整合型質粒；熒光蛋白

在酵母表達蛋白以及其他有機產物的過程中，通過增強轉化過程中的酶活性來加快產物生成是研究者公認的觀點，而高表達特異性酶是解決問題的主要途徑。尋找1個新穎匹配的啟動子或構建1個高效表達系統是非常困難且需要大量的時間。向宿主細胞中引入大量目的基因是最先廣泛采用的方法。在酵母表達過程中，傳統的表達載體YEP，YCP和YIP常常被用來引入外源基因。但是，YCP和YIP存在低拷貝的缺點，而YEP表達不穩定[1]。高拷貝數地將目的基因整合入酵母基因組是高表達且穩定的必要途徑。酵母自動復制區作為酵母染色體復制起點，在染色體復制過程中起著至關重要的作用[2-3]。如果這些位點發生突變會導致ARS失去活性，進而影響到復制起始的功能[4]。其活性還可能與其他諸如ARS側翼序列特征，染色體定位，染色體修飾等因素有關。每條染色體復制都是在間隔40～100 kb的多個位點起始的，每個起點在1個細胞周期的中期S期相繼被激活，起始1次染色體復制[5-7]。在酵母基因組中，存在著300多個自動復制區，而找到高效的自動復制區是構建高拷貝質粒的前提。本實驗在釀酒酵母整合載體pNTS2K中的NdeI和EcoRI之間(見圖1)分別引入4種ARS，篩選出高效的復制區ARS315，從而構建了一種高效的復制整合型載體pNTS2K-ARS315。通過質粒pNTS2K-ARS315表達熒光蛋白，其表達效果高于普通商業質粒。因此，這種質粒可以在G418抗性基因KanMX兩側，2個rDNA片段之間(見圖1)引入多個表達框。隨著G418抗性的選擇壓力，盡可能多的將外源基因表達框整合在酵母基因組多拷貝rDNA區域，為以后外源基因的高效穩定表達奠定了基礎。

圖1 pNTS2K質粒圖譜Fig.1 pNTS2K plasmid map

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌種

釀酒酵母整合載體pNTS2K由本實驗室構建，以pUC19為骨架，引入rDNA 整合區片段及KanMX表達框，如圖1所示。大腸桿菌(E.coli)DH5α，釀酒酵母(S.cerevisiae)Juk36a (URA3缺陷型)由本實驗室保存。

1.1.2 酶和試劑

酵母基因組提取試劑盒、DNA聚合酶以及Phusion高保真酶購買于Thermo Scientific 公司；限制性內切酶和T4連接酶購買于NEB公司；LB培養基、YPD培養基、氨芐青霉素(Amp)以及G418購買于Sigma公司，引物也由Sigma 公司合成。

1.2 方法

1.2.1 質粒的構建

用酵母基因組提取試劑盒提取Juk36a基因組DNA。由于ARS活性可能與諸如ARS側翼序列特征、染色體定位和染色體修飾等因素有關[8]，所以根據NCBI上S288c基因組序列，針對各ARS序列上下游200 bp處設計4對特異性引物(見表1)分別擴增ARS304、ARS315、ARS735和ARS1512片段，并在上下游引物5’末端引入NdeI和EcoRI酶切位點。PCR擴增條件為98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 1 min, 循環30次；72 ℃ 2 mins；4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，用膠回收試劑盒回收特異性條帶。用限制性內切酶NdeI和EcoRI雙酶切膠回收產物和pNTS2K質粒。純化酶切反應液后，用T4連接酶連接，轉化DH5α感受態細胞。經菌落PCR鑒定后，挑取陽性轉化子37 ℃過夜培養。然后提取質粒，并用NdeI和EcoRI酶切鑒定。

表1 PCR引物序列

1.2.2 酵母轉化

將所得到的正確質粒pNTS2K-ARS304、pNTS2K-ARS315、pNTS2K-ARS 735和 pNTS2K-ARS1512(如表2所示)用Nanodrop檢測濃度后，分別稀釋到100 ng/μL。按照Gene Pulser XcellTMElectroporation System 標準方法，分別將5 μL質粒加入到40 μL酵母感受態細胞中進行電轉[9]，然后分別涂布于含有300 μg/mL G418的YPD平板上，培養3天后挑取轉化子。轉化率=轉化子數/質粒DNA質量。

表2 質粒

1.2.3 轉化子的復篩及比較

最終OD600 nm的測量是衡量細菌產量的標準，也是細菌生長率的體現，是外源基因高表達的必要前提[10]。因此，從生長出的不同轉化子中(如表3所示)分別挑出5個最大的單克隆于2 mL YPD培養基中培養過夜，以OD600nm為0.05轉接到5 mL含有500 μg/mL G418的YPD培養基中培養48 h，測OD600nm吸光值。

表3 菌株

1.2.4 復制能力的比較及檢測

將生長能力最強的Juk36a(pNTS2K-ARS315)菌株分別接種于含有不同梯度的G418的YPD培養基的24孔培養板中，每孔培養體積為0.6 mL，放入InfiniteF200PRO (TECAN)中監測40 h得到生長曲線。

1.2.5 質粒的應用及檢測

將得到的復制能力最強的質粒pNTS2K-ARS315為骨架，以本實驗室普通商業酵母表達載體pPY1(以2micron 為復制區，由本實驗室保存)作為對照，分別引入熒光蛋白表達框。經過酶切、連接，轉化到DH5α感受態細胞中。經菌落PCR鑒定后，挑取陽性轉化子37℃過夜培養，提取重組質粒pNTS2K-ARS315-EGFP和pPY1-EGFP(如表2所示)。然后將得到的質粒轉化到釀酒酵母Juk36a(URA3缺陷型)中，檢測轉化子36a(pNTS2K-ARS315-EGFP)和36a(pPY1-EGFP)(如表3所示)的熒光強度。

2 結果與分析

2.1 ARS片段的獲得及質粒的構建

以釀酒酵母Juk36a基因組為模板擴增ARS304(930 bp)，ARS315(584 bp)，ARS735(844 bp)和ARS1512(1042 bp)4條序列，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物結果如圖2所示。從圖2中可以看出，目的條帶單一，大小與預期結果一致。

M-DNA標記；1-ARS304 PCR片段；2-ARS315 PCR片段；3-ARS735 PCR片段；4-ARS1512 PCR片段圖2 自動復制區序列 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of ARS PCR production

將PCR產物回收后，分別用NdeI和EcoRI雙酶切，然后連接到整合載體pNTS2K上，轉化到大腸桿菌DH5α中，進行大腸桿菌菌落PCR鑒定，挑取鑒定后的陽性克隆培養，提取質粒，NdeI和EcoRI雙酶切鑒定結果如圖3所示。

從圖3中可以看出，各重組質粒經雙酶切得到2條帶，對照質粒pNTS2K得到1條帶，且大小都與預期相符.同時，將所得陽性質粒送往公司測后，NCBI比對與S288C釀酒酵母相關ARS序列一致。

M-DNA標記；C-對照質粒pNTS2K；1-質粒pNTS2K-ARS304；2-質粒pNTS2K-ARS315；3-質粒pNTS2K-ARS735；4-質粒pNTS2K-ARS1512圖3 重組質粒酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Digest verification of recombinant plasmid

2.2 酵母轉化子的獲得

在相同條件下，由于單細胞內質粒拷貝數的多少直接影響細胞抗性能力的強弱，所以酵母轉化效率以及轉化子單克隆大小是鑒定ARS自主復制活性強弱的直接指標。本實驗以整合質粒pNTS2K為陽性對照，將構建好的含ARS復制區的復制整合型質粒pNTS2K-304、pNTS2K-315、pNTS2K-735和pNTS2K-1512電轉化釀酒酵母Juk36a后，在YPD平板上篩選耐G418的轉化子。根據酵母轉化率以及克隆大小初步評估4種復制區自主復制能力，結果見圖4。從圖4中可以看出，4種重組質粒轉化酵母后都能在含有300 μg/mL G418的YPD平板上產生大量的轉化子，且克隆明顯多且大于對照組。還可以看出，轉化子36a(pNTS2K-ARS315)和36a(pNTS2K-ARS1512)克隆大小較其他2組要大。上述結果說明這4條ARS都具有獨立自主復制能力，且ARS315和ARS1512復制能力可能較強。經統計分析，各種重組質粒轉化率如圖5所示。從圖5中可以看出，4種重組質粒的轉化率(轉化子數/ng DNA)分別為63,57,41和32，明顯高于對照組。對照組pNTS2K的復制依賴于其整合到染色體DNA上，轉化率低(5個轉化子/ng DNA)。這也初步說明了4條ARS都具有獨立自主復制能力。轉化率只是代表質粒是否存在于細胞中，可初步地判斷質粒在細胞中的穩定性，而單克隆的大小及抗性的強弱則代表拷貝數的多少及穩定性。所以，雖然質粒pNTS2K-315 的轉化率略低于pNTS2K-304，但轉化子單克隆明顯較大，這說明質粒pNTS2K-315以更多的拷貝存在于單細胞中，表達特異性蛋白更多，對G418耐受性更強。這進一步說明了ARS315復制能力可能會更強。

質粒pNTS2K的酵母轉化子；36a(pNTS2K-ARS304)：質粒pNTS2K-ARS304的酵母轉化子；36a(pNTS2K-ARS315)：質粒pNTS2K-ARS315的酵母轉化子；36a(pNTS2K-ARS735)：質粒pNTS2K-ARS735的酵母轉化子；36a(pNTS2K-ARS1512)：質粒pNTS2K-ARS1512的酵母轉化子圖4 轉化子在含300 μg/mL G418的YPD平板上生長情況Fig.4 Transformants growth on the YPD plate with 300 μg/mL

C-對照質粒pNTS2K轉化率；ARS304-重組質粒pNTS2K-ARS304轉化率；ARS315-重組質粒pNTS2K-ARS315轉化率；ARS735-重組質粒pNTS2K-ARS735轉化率；ARS1512-重組質粒pNTS2K-ARS1512轉化率圖5 重組質粒轉化率(轉化率=轉化子數/質粒DNA的質量)Fig.5 Transformation rate of recombinant plasmids (Transformation rate=Number of transformants/quality of plasmid DNA)

2.3 四種轉化子抗性生長比較

為了進一步篩選出復制能力最強的ARS，從所得到的轉化子中各挑取5個最大的單克隆于2 mL YPD 培養基中培養過夜，以OD600nm為0.05轉接到含有500 μg/mLG418的5 mL YPD培養基中培養48 h后，分別測OD600nm處的吸光值，結果如圖6所示。含pNTS2K-ARS315重組質粒的轉化子生長OD最高，平均為8.55；對照組pNTS2K質粒的轉化子生長OD最低，平均為0.57。這也進一步說明了4條ARS都具有獨立自主復制能力，其中ARS315復制能力最強。

C-對照轉化子36a(PNTS2K)吸光值；ARS304-轉化子36a(pNTS2K-ARS304)吸光值；ARS315-轉化子36a(pNTS2K-ARS315)吸光值；ARS735-轉化子36a(pNTS2K-ARS735)吸光值；ARS1512-轉化子36a(pNTS2K-ARS1512)吸光值圖6 四種轉化子抗性生長比較(該數值為5組獨立實驗的平均值和標準差)Fig.6 The resistance comparison of the four transformants (Values are given as the average and standard deviation of five independent experiments)

2.4 ARS315復制能力的檢測

為了檢測ARS315的獨立自主復制能力，將轉化子36a(pNTS2K-ARS315)接種于含不同梯度的G418的YPD培養基中，在InfiniteF200PRO中監測生長曲線，結果如圖7所示。從圖7可以看出，36a(pNTS2K-ARS315)在含1 mg/mL G418以下濃度的YPD中均能很好地生長，在含1 mg/mL G418以上濃度的YPD中生長明顯受到抑制。這說明pNTS2K-ARS315能夠在釀酒酵母中高表達且能抵御1 mg/mL 高濃度G418的毒性，進一步說明了pNTS2K-ARS315有很強的復制能力且以高拷貝的形式存在于酵母細胞中。

圖7 轉化子36a (pNTS2K-ARS315)不同濃度梯度G418耐受性檢測(該數值為5組獨立實驗的平均值和標準差)Fig.7 The tolerance of transformant 36a (pNTS2K-ARS315) to different concentrations of G418(Values are given as the average and standard deviation of five independent experiments)

2.5 復制整合型載體pNTS2K-ARS315表達能力檢測

為了檢測質粒pNTS2K-ARS315是否能正常表達其它蛋白及其表達能力。將得到的含熒光蛋白的質粒pNTS2K-ARS315-EGFP和pPY1-EGFP轉化酵母后，都能得到發熒光的轉化子36a(pNTS2K-ARS315-EGFP)和36a(pPY1-EGFP)，如圖8所示。

圖8 轉化子在熒光顯微鏡下，放大1 000倍的發光狀態Fig.8 The fluorescence performance of transformants under fluorescence microscope magnified 1 000 times

在熒光顯微鏡下，以ARS315為復制區的表達載體表達的熒光蛋白的轉化子36a(pNTS2K-ARS315-EGFP)產生的熒光強度明顯較強。此外，使用流式細胞儀進一步檢測兩種轉化子，結果如圖9所示，從圖9可以看出，轉化子36a(pNTS2K-ARS315-EGFP)所產生的帶熒光的細胞較36a(pPY1-EGFP) 明顯多且強[11]。這說明以高效復制能力的ARS315為復制區的表達載體表達水平更高。

圖9 流式細胞儀檢測轉化子熒光強度Fig.9 The fluorescence idensity of transformants measured by flow cytometry

為了進一步檢查表達水平的穩定性，將帶有熒光的轉化子分別挑取10個單克隆，接種于YPD培養基中培養48 h，在InfiniteF200PRO中檢測比熒光強度(FIC)和OD595nm，結果如圖10所示。從圖10可以看出，轉化子36a(pNTS2K-ARS315-EGFP)在YPD中培養48h后，產生的比熒光強度較36a(pPY1-EGFP)強3倍。這也進一步證明了pNTS2K-ARS315有很強的復制能力且以高拷貝的形式穩定存在于酵母細胞中。

圖10 轉化子比熒光強度的檢測(該數值為10個單克隆菌株獨立實驗的平均值和標準差)Fig.10 The measurement of transformants fluorescence density rate (Values are given as the average and standard deviation of ten single colonies independent experiments)

3 討論

在釀酒酵母的每個復制周期中，實際被激活的復制區較少。雖然大多數ARS都能被復制起始識別復合體(Origin recognition complex, ORC)結合[12]，但其中有些復制區被激活的頻率比其他要高，ARS315能在約90%的細胞循環中啟動復制[13]。當這些復制區克隆到載體上時，這些序列也能行使獨立自主復制的功能[14]。而來自轉座子Tn903的G418抗性基因KanMX應用較為廣泛，并能通過提高G418的濃度篩選出高拷貝的轉化子[15]。構建一種既能獨立自主復制，又能將外源基因整合到染色體的載體，優點是可以自由調節外源基因在宿主中的拷貝數[16]，從而達到代謝路徑通暢且代謝平衡。本實驗證實四種復制區都能在釀酒酵母中獨立自主復制，其中ARS315復制能力最強，其轉化子36a(pNTS2K-ARS315)能在含高達1 mg/mL G418的YPD培養基中正常生長, 而且該質粒能高效表達熒光蛋白。因此，ARS315可用于構建高拷貝且穩定的重組質粒，為釀酒酵母進行基因工程改造建立了技術平臺。

[1] YAMADA R,TANAKA T,OGINO C,et al.Gene copy number and polyploidy on products formation in yeast[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2010,88(4):849-857.

[2] DESHPANDE A M,NEWLON C S.The ARS consensus sequence is required for chromosomal origin function inSaccharomycescerevisiae[J]. Molecular and Cellular Biology,1992,12(10):4 305-4 313.

[3] YANG C,THEIS J F,NEWLON C S.Conservation of ARS elements and chromosomal DNA replication origins on chromosomes III ofSaccharomycescerevisiaeandS.carlsbergensis[J].Genetics,1999,152(3):933-941.

[4] THEIS J F,NEWLON C S.Two compound replication origins inSaccharomycescerevisiaecontain redundant origin recognition complex binding sites[J].Molecular and Cellular Biology, 2001,21(8):2 790-2 801.

[5] FENG W, COLLINGWOOD D, BOECK M E,et al.Genomic mapping of single-stranded DNA in hydroxyurea-challenged yeasts identifies origins of replication[J].Nature Cell Biology, 2006,8(2):148-155.

[6] YABUKI N,TERASHIMA H,KITADA K.Mapping of early firing origins on a replication profile of budding yeast[J].Genes to Cells,2002,7(8):781-789.

[7] WYRICK J J,APARICIO J G,CHEN T, et al.Genome-wide distribution of ORC and MCM proteins inS.cerevisiae: high-resolution mapping of replication origins[J].Science,2001,294(5 550):2 357-2 360.

[8] EATON M L,GALANI K,KANG S,et al.Conserved nucleosome positioning defines replication origins[J].Genes & Development,2010,24(8):748-753.

[9] SUGA M,HATAKEYAMA T.High-efficiency electroporation by freezing intact yeast cells with addition of calcium[J]. Current Genetics,2003,43(3):206-211.

[10] KIM B, DU J, ERIKSEN D T, et al. Combinatorial design of a highly efficient xylose-utilizing pathway inSaccharomycescerevisiaefor the production of cellulosic biofuels[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79(3): 931-941.

[11] SHI Shuo-bo,LIANG You-yun,ZHANG Ming-zi M,et al.A highly efficient single-step, markerless strategy for multi-copy chromosomal integration of large biochemical pathways inSaccharomycescerevisiae[J].Metabolic Engineering,2016,33: 19-27.

[12] SANTOCANALE C,DIFFLEY J F.ORC-and Cdc6-dependent complexes at active and inactive chromosomal replication origins inSaccharomycescerevisiae[J].The EMBO Journal,1996,15(23):6 671.

[13] NEWLON C S, COLLINS I, DERSHOWITZ A, et al. Analysis of replication origin function on chromosome III ofSaccharomycescerevisiae[C].Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993, 58: 415-423.

[14] VUJCIC M,MILLER C A,KOWALSKI D.Activation of silent replication origins at autonomously replicating sequence elements near the HML locus in budding yeast[J].Molecular and Cellular Biology,1999,19(9):6 098-6 109.

[15] SCORER C A,CLARE J J,MCCOMBIE W R,et al.Rapid selection using G418 of high copy number transformants ofPichiapastorisfor high-level foreign gene expression[J].Nature Biotechnology,1994,12(2):181-184.

[16] SHEN Y, MURAMATSU S I, IKEGUCHI K,et al.Triple transduction with adeno-associated virus vectors expressing tyrosine hydroxylase, aromatic-L-amino-acid decarboxylase, and GTP cyclohydrolase I for gene therapy of Parkinson's disease[J].Human Gene Therapy,2000,11(11):1 509-1 519.

A high effective autonomous replicative sequence inSaccharomycescerevisiae

SHEN Fang-lin1,3, HUANG Shuang-cheng2, HOU Peng-chen2, GENG An-li2, RUAN Wen-quan1,3*

1(School of Environment and Civil Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(School of Life Sciences and Chemical Technology, Ngee Ann Polytechnic, Singapore) 3(Jiangsu Key Laboratory of Anaerobic Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In the case of yeast expression, low-copy number of transformed genes and low stability are disadvantages of the conventional types of expression vectors. Therefore, finding a high effectiveSaccharomycescerevisiaeautonomously replicative sequence (ARS) that can be used for construction of replicative/ integrated plasmid is significantly important. In this study, four different ARSs (ARS304, ARS315, ARS735, and ARS1512) were amplified fromSaccharomycescerevisiaeand inserted into integrated yeast vector pNTS2K and four plasmids pNTS2K-ARS304, pNTS2K-ARS315, pNTS2K-ARS735, pNTS2K-ARS1512 were obtained. All the four plasmids were successfully transformed intoS.cerevisiaeand all transformants were able to grow on YPD plate containing 300 μg/mL of G418. However, only transformant containing plasmid pNTS2K-ARS315 was able to grow well in the YPD medium containing 500 μg/mL of G418. After G418 tolerance detection, 36a (pNTS2K-ARS315) still could grow well in YPD medium containing 1 mg/mL of G418. Furthermore, the expression of the fluorescent protein by the plasmid pNTS2K-ARS 315 was higher than that by the ordinary commercial plasmid. It can be concluded that all of the four ARSs functioned and the ARS315 had the highest replicate ability inS.cerevisiae. Consequently, ARS315 can be potentially used for high expression and stable recombinant strain construction and metabolic engineering ofS.cerevisiae.

Saccharomycescerevisiae; autonomously replicative sequence; high copy number replicative/ integrated plasmid；fluorescent protein

碩士研究生(阮文權教授為通訊作者,E-mail: wqruan@jiangnan.edu.cn)。

Science and Engineering Research Council of the Agency for Science, Technology and Research(A*STAR)(029 139 0035)

2016-09-23，改回日期：2016-12-07