糖膠樹花次生代謝產物及其抗細菌活性

張偉豪++劉易++王小晴++方萍++宋慧云++王軍++單體江

摘 要 采用水蒸氣蒸餾法提取糖膠樹花揮發油，通過氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）對揮發油進行成分分析，采用薄層層析——生物自顯影法測定糖膠樹花乙酸乙酯層提取物對供試細菌的抑制活性。結果表明，糖膠樹花揮發油得率為0.018%，通過GC-MS分析，從中鑒定出20個成分，占揮發油總量的97.53%，其主要成分為2-莰烯（23.30%），芳樟醇（23.09%），（-）-4-萜品醇（10.54%）。糖膠樹花乙酸乙酯層提取物對大腸桿菌表現出較強的抑制活性，其次為黃瓜角斑病菌，對其他供試細菌未表現出抑制活性。

關鍵詞 糖膠樹 ；揮發油 ；次生代謝產物 ；抗細菌活性

中圖分類號 S476 ；R284 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.03.021

Chemical Analysis and Antibacterial Activity of the

Extract from Alstonia scholaris

ZHANG Weihao LIU Yi WANG Xiaoqing

FANG Ping SONG Huiyun WANG Jun SHAN Tijiang

（Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest

Plant Germplasm， College of Forestry and Landscape Architecture，

South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642）

Abstract The volatile oil from the flowers of Alstonia scholaris was extracted by hydro-distillation， and its chemical components were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The antibacterial activity of the ethyl acetate extract against bacteria was analyzed by thin layer chromatography bio-autography method. The results showed that the flowers of A. scholaris was extracted to yield 0.018% of volatile oil. The GC-MS analysis showed that 20 components were identified from the volatile oil of the flowers and accounted for 97.53% of total volatile substance. The major components of the volatile oil included 1，7，7-trimethylbicyclo[2.2.1] hept-2-ene （23.30%）， 3，7-Dimethyl-1，6- octadien-3-ol （23.09%） and （-）-4-Terpineol （10.54%）. The ethyl acetate extracts showed certain antibacterial activity against Escherichia coli and Pseudomonas lachrymans， but not against the other bacteria under test.

Keywords Alstonia scholaris ； volatile oil ； chemical component ； antibacterial activity

糖膠樹[Alstonia scholaris R. Br.]，又稱燈架樹、面條樹，屬于夾竹桃科雞骨常山屬，主要分布在廣西南部、西部和云南南部，廣東、湖南和臺灣等地[1]。糖膠樹的根、樹皮、葉均可入藥。在印度，用其樹皮、葉及乳汁來治療瘧疾和發汗[2]；在我國民間，則用其樹皮來治頭痛、傷風、痧氣、肺炎、百日咳等，外用可治外傷止血、接骨、消腫、瘡節以及殺蟲劑的配制等[3-4]。糖膠樹喜濕潤肥沃土壤，在水邊生長良好，是次生闊葉林主要樹種，因其樹形優美，常作為行道樹等觀賞用樹[1，5]。隨著糖膠樹的廣泛種植，其花期濃烈的氣味也引起人們的廣泛關注。植物精油又稱揮發油，屬于植物次生代謝產物，具有廣譜抑菌殺菌活性和消炎功能，能使人適度興奮、減緩疲勞產生松弛感等[6-9]，植物精油可作為協同增強劑，與標準藥物聯合使用時產生強于個體效應的聯合效應，并產生增強的抗菌活性[10-11]。目前，關于糖膠樹花揮發油的研究較少，且尚未見糖膠樹花次生代謝產物抗菌活性的報道。本研究采用水蒸氣蒸餾法提取糖膠樹花揮發油，并通過GC-MS分析測定其化學組成。同時采用甲醇冷浸提取和乙酸乙酯萃取得到糖膠樹花提取物，通過薄層層析-生物自顯影法（TLC-MTT-生物自顯影法）測定乙酸乙酯層提取物對供試細菌的抑菌活性，為闡明糖膠樹花揮發油的化學組成以及糖膠樹的綜合開發和利用提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料

糖膠樹花于2015年11月21日采自華南農業大學校園，標本由華南農業大學林學與風景園林學院鄭明軒老師鑒定。

供試細菌：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，G+），溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus，G+），根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens，G-），大腸桿菌（Escherichia coli，G-），黃瓜角斑病菌（Pseudomonas lachrymans，G-），桉樹青枯菌（Ralstonia solanacearum，G-），番茄瘡痂病菌（Xanthomonas vesicatoria，G-）。以上菌株由華南農業大學林學與風景園林學院森林保護教研室提供。

6890N-5975C氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）（美國安捷倫科技有限公司）；水蒸氣蒸餾裝置（北京永光明醫療儀器廠）；硫酸鏈霉素（美國Sigma公司，99%）；MTT（美國Sigma公司）；C8-C40系列正構烷烴（美國Sigma公司）；氯化鈉、無水乙醚、無水硫酸鈉、二氯甲烷等均為國產分析純（北京化學試劑公司）。

1.2 方法

1.2.1 揮發油的提取及GC-MS分析

參照Lou等[12]和劉易等[13]的方法提取揮發油。采集糖膠樹花（1 123 g），稱重后裝入水蒸氣蒸餾裝置內，加入適量蒸餾水，待溫度升至180℃后連續蒸餾6 h，收集回流所得的揮發油，加入一定量的氯化鈉，用無水乙醚萃取3次，合并萃取液，加入無水硫酸鈉干燥處理，讓無水乙醚自然揮發，4℃密封保存備用。

糖膠樹花揮發油化學組分的鑒定在6890N-5975C GC-MS（Agilent Technologie，USA）上進行，毛細管色譜柱為DB-5（30 m × 250 μm × 0.25 μm），無分流進樣，進樣口溫度230℃，進樣量1 μL。升溫程序：起始溫度70℃，保持1 min；然后8℃/min上升到120℃，保持1 min；以30℃/min上升到150℃，保持1 min；再以5℃/min上升到175℃，保持0 min；然后以1℃/min上升到180℃，保持0 min；最后5℃/min上升到240℃，保持0 min。離子源溫度230℃，電離方式為EI，電離能量70 eV，載氣為He，流速1 mL/min，全掃描采集，質譜檢測器（MSD）檢測。通過與NIST（2011）中標準化合物的保留時間和質譜圖作對比，確定待測成分。

1.2.2 糖膠樹花乙酸乙酯層提取物抗菌活性測定

將采集的糖膠樹花剪碎，裝入三角瓶，加入適量甲醇，冷浸提取3次，每次7 d。過濾后濃縮提取液，水混懸后用乙酸乙酯萃取3次，濃縮萃取液，得到乙酸乙酯層提取物，4℃保存，備用。

采用TLC-MTT-生物自顯影法測定其抗細菌活性[14-16]。將提取物用乙酸乙酯溶解，用直徑為0.5 mm的毛細管點樣，點樣量為5 μL，點樣點越小越好。采用石油醚和丙酮的4∶1（V/V）的混合液為展開劑進行薄層層析，薄層層析后，在薄層板的一側原點處點5 μL濃度為0. 2 mg/mL 的硫酸鏈霉素作為陽性對照，備用。向滅菌的LB半固體培養基（瓊脂濃度為0.5%）中加入一定量準備好的菌液（45 mL LB+5 mL菌液），將其濃度調至約108 CFU/mL，振蕩均勻。用噴樣器將制備好的菌懸液均勻噴灑到層析后的硅膠板上；待培養基在硅膠板上冷卻后，將硅膠板置于培養皿中于4℃冰箱中放置4 h，以利于抗菌成分的擴散；而后將培養皿置于28℃下保溫培養，12 h后取出硅膠板，在其上均勻噴灑噻唑藍（MTT），約10 min后即可觀察實驗結果。有抗菌活性成分處，供試菌由于受到抑菌成分的抑制而出現抑菌斑；無抗菌活性成分處，供試菌正常生長，通過MTT顯色后出現背景色藍色。通過抗菌斑點的遷移率（即Rf值）來初步評價樣品中抗菌化合物的數量和極性，根據抗菌斑點的大小來初步評價化合物的活性和含量。Rf值計算公式如下：

Rf值=■

2 結果與分析

2.1 糖膠樹花揮發油GC-MS分析

通過水蒸氣蒸餾法，糖膠樹花揮發油的得率為0.018%（以鮮重為基礎）。糖膠樹花揮發油總離子流色譜圖如圖1。

采用峰面積歸一化法計算出各組分的相對百分含量，并進行定量分析，結果見表1。通過GC-MS分析，從糖膠樹花揮發油中共鑒定出21個成分，占揮發油總量的97.53%。主要成分是2-莰烯（23.30%），芳樟醇（23.09%），（-）-4-萜品醇（10.54%），α-甲基-α-（4-甲基-3-戊烯基）-環氧乙烷甲醇（9.19%），鐵銹羅漢柏醇（5.68%），其余成分相對含量均在5%以下。得到的揮發油化合物主要為醇類（57.53%）和烴類（28.51%），其相對含量見圖2，說明糖膠樹花揮發油中含有種類豐富的化合物。

2.2 糖膠樹花乙酸乙酯層提取物的抗菌活性結果

采用TLC-MTT-生物自顯影法測定了糖膠樹花乙酸乙酯提取物對6種供試細菌的抑制活性，陽性對照為硫酸鏈霉素，結果見表2。糖膠樹花乙酸乙酯提取物對大腸桿菌表現出最強的抑制活性， Rf值為0.28～0.45，抑菌斑的最大直徑在5.6～10 mm；其次是黃瓜角斑病菌，在Rf值為0.31～0.40（+），0.42～0.43（+）的范圍內表現出抑菌活性，抑菌斑的最大直徑為4 mm。糖膠樹花乙酸乙酯層提取物對其他供試細菌未表現出抑制活性。硫酸鏈霉素對黃瓜角斑病菌的抑制活性最強，抑菌斑的直徑大于10 mm，而對其他供試細菌的抑菌斑直徑均在5～10 mm。

3 討論

通過本研究發現，糖膠樹花揮發油中相對含量較高的成分主要為2-莰烯（23.30%）、芳樟醇（23.09%）和（-）-4-萜品醇（10.54%）。莰烯可以作為合成香料的重要原料[17-18]，以莰烯為原料合成的衍生物在精細化工、醫藥、食品、材料等各個行業有實際應用價值[19-21]。芳樟醇是香水香精、家化產品香精及皂用香精配方中使用頻率最高的香料品種，也用于配制食用香精，現在全世界用于配制各種香精的芳樟醇達 1萬多t[22]。芳樟醇也是重要的化工原料，用于合成各種芳樟酯類香料并具有廣譜抗細菌真菌、抗寄生蟲、抗害蟲、抗氧化等作用[23]。而萜品醇具有平喘，止咳，祛痰作用，可將糖膠樹花中成分開發成安全有效的平喘藥物[24]。不同的提取方法對揮發油的化學組成和相對含量影響較大。張宏意等[25]采用乙醚超聲提取法提取糖膠樹花揮發油，通過GC-MS分析鑒定出19種成分，其中主要成分為角鯊烯，相對含量高達39.44%，而本研究采用水蒸氣蒸餾法提取其揮發油，從中鑒定出21種組分，但并未檢測到角鯊烯。由于角鯊烯是高度不飽和烴類化合物，分子量大，沸點高（280℃），難揮發[26]，通過水蒸氣蒸餾法難以獲得。此外，張宏意等獲得的揮發油中芳樟醇的相對含量只有5.05%，遠低于本實驗中的23.09%。所以對于需要分離不同的物質，根據需要使用不同的工藝可以取得更好的效果。糖膠樹花揮發油中的某些組分在藥用和商用上有巨大潛力，本實驗可以為進一步開發和利用糖膠樹提供參考。

而乙酸乙酯提取物對于常見的幾種細菌并未表現出較好的抗菌活性，僅對大腸桿菌的抑菌效果與陽性對照硫酸鏈霉素效果相當，說明從糖膠樹花揮發油中可開發利用抗大腸桿菌的物質。Khan等[27]的研究結果表明，糖膠樹的葉、莖和根皮提取物都對革蘭氏陽性和陰性細菌有抑制作用，其丁醇提取物對細菌的作用效果尤其顯著，但沒有對花進行研究，說明在其他部位或者通過其他方法提取抗菌物質仍有待深入研究。

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