茶多糖對小鼠腸道健康及免疫調節功能的影響

李海珊，劉麗喬，聶少平*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

茶多糖對小鼠腸道健康及免疫調節功能的影響

李海珊，劉麗喬，聶少平*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

本實驗以從江西婺源綠茶中提取的茶多糖（tea polysaccharides，TPS）為研究材料，研究不同劑量TPS對正常小鼠腸道健康及免疫調節功能的影響。實驗小鼠隨機分為正常組和低、中、高劑量TPS干預組。TPS干預21 d后，收集小鼠腹腔巨噬細胞，進行中性紅吞噬實驗檢測腹腔巨噬細胞的吞噬能力，解剖獲取小鼠脾臟、胸腺后稱其質量并計算脾指數和胸腺指數。氣相色譜法檢測小鼠結腸內容物中短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）的含量；靛酚藍比色法測定結腸內容物中氨含量；pH計檢測結腸內容物pH值；恒質量法檢測結腸內容物含水量。結果顯示：高、中、低劑量TPS干預組的小鼠免疫器官指數均顯著增大，腹腔巨噬細胞吞噬能力呈劑量依賴性增強，結腸內容物的乙酸，丙酸和正丁酸的含量升高，而異丁酸、正戊酸、異戊酸的含量無明顯變化；結腸內容物中氨含量下降，結腸內容物pH值下降，含水量升高。實驗結果提示TPS具免疫調節功能及促進小鼠腸道健康的作用。

茶多糖；免疫調節；腸道健康

茶作為當今世界的一種日常飲料，主要分為綠茶、烏龍茶、紅茶、黑茶等[1]，每年約有30億 kg茶葉被生產和消費[2]。近年來，綠茶因其抗氧化、抗腫瘤、降血糖等生物學活性被發現而備受關注[3]。綠茶的功效與其有效成分（茶多酚、茶多糖、茶氨酸、瞟呤堿等）有直接聯系，而茶多糖（tea polysaccharides，TPS）作為其中含量最豐富的功能成分，有較大的研究和應用前景。TPS是一類與蛋白質結合在一起的多糖或糖蛋白[4]。隨著對TPS生物學活性的深入發掘，它被證實具有多種生物學功效，例如降血糖[5-6]、抗疲勞[7]、抗氧化[8-9]、保肝作用[10]、抗凝血[11]、免疫調節[12]等，具有廣泛的應用前景。

近年來，大量研究已證實多糖對機體免疫系統具有重要調節作用，植物多糖可通過與免疫細胞表面的多種受體結合來激活不同的信號通路進而調控動物機體的免疫系統，包括：刺激巨噬細胞、T/B淋巴細胞、自然殺傷細胞的分泌或增殖；調節細胞因子的釋放；促進抗體的分泌；激活補體系統等[13]。越來越多的研究證明多糖不能被人體胃腸道消化，但其在結腸內可被腸道菌群選擇性分解及發酵，產生短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）[14]。SCFAs主要包括乙酸、丙酸及丁酸等。乙酸是腸道細菌在結腸中發酵多糖的主要產物，被吸收后可促進機體膽固醇的合成；丙酸可進入糖異生途徑；丁酸是結腸、盲腸的首選能源物質[15]。然而，腸道菌群的代謝也可能會產生一些對機體健康有害的物質，如氨和硫化氫[16]。SCFAs和氨類物質作為腸道菌群代謝產物的代表，其含量變化在一定程度上反映了腸道環境的健康狀態。胃腸道作為人體主要的消化吸收器官，其pH值的變化影響食物的消化吸收，與人體健康相關。

本實驗以江西婺源綠茶為原料，通過水提醇沉法提取茶葉粗多糖，并通過Sevag法脫蛋白純化后獲得精多糖，研究不同質量濃度TPS對正常小鼠腸道健康及免疫調節作用的影響，實驗小鼠隨機分為正常組和低、中、高劑量TPS干預組，干預21 d后，檢測小鼠免疫器官指數和腹腔巨噬細胞的吞噬能力，探究TPS對正常C57/BL6小鼠的免疫調節功能的影響。實驗測定結腸內容物中SCFAs、氨類物質含量、pH值及含水量的變化，觀察TPS對正常小鼠腸道健康的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

S P F級C 5 7/B L 6小鼠，4～6 周齡，體質量（20.0±0.2）g，資格證號：SCXK（湘）2012—0003，購自湖南斯萊克實驗動物有限公司。實驗中所有動物嚴格遵守南昌大學動物管理條例，倫理委員會鑒定許可。飼料、墊料均購買于湖南斯萊克實驗動物有限公司，經過輻照殺菌用于動物的飼養。純凈水、生理鹽水均經過高壓滅菌處理。

茶多糖由南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室制備。粗老綠茶購自江西婺源，水提醇沉法提取粗多糖，Sevag法脫蛋白純化獲得精制茶多糖，通過高效滲透凝膠色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法的分析，表明所制備茶葉多糖為均一多糖。測得組分中糖含量為55.1%，蛋白質含量為1.8%，離子色譜分析得出茶葉多糖中含有半乳糖醛酸，含量為33.5%。樣品中糖、糖醛酸、蛋白質三者相加含量超過90%，表明所制得精制茶葉多糖純度較高，雜質較少。分子質量約為289 734 D。氣相色譜（gas chromatography，GC）分析確定茶葉多糖主要由鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其物質的量比為1.26∶3.18∶4.08∶1.00∶1.52∶3.92[4]。

高純度SCFAs標準品：乙酸（純度100%）、正戊酸（純度99.9%） 德國Merck公司；丙酸（純度100%）比利時Janssen Chimica公司；異丁酸（純度99.9%）、正丁酸（純度100%）、異戊酸（純度100%）、4-甲基戊酸（內標物） 美國Sigma公司。所有有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AL04電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TDL-SA離心沉淀機 上海安亭分析儀器有限責任公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；超低溫冰箱、MULTISKAN MK3酶標儀、Series II細胞培養箱3110 美國Thermo Scientif i c公司；TU-1900雙光束紫外分光光度計 北京通用儀器有限責任公司；QL-861渦旋儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；3k15離心機 德國Sigma公司；連續可調微量移液器（1 mL、200、10 μL） 德國Eppendorf公司；DGG-9140B電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森倍實驗儀器有限公司；PHS-3B精密pH計 上海雷磁有限公司；Agilent 6890 N氣相色譜系統（190901N-213火焰離子化檢測儀（flame ionization detector，FID）及HP-INNOWAX柱） 美國Agilent公司；超凈工作臺 吳江市凈化設備總廠；ZDX-35B高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；CKX41倒置顯微鏡日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗

48只C57/BL6小鼠置于SPF級動物房恒溫恒濕飼養，保證12 h/12 h燈光/黑暗循環，并給予基本膳食、足夠飲用水，定時更換墊料并清洗籠子。適應性飼養1 周后隨機分為生理鹽水處理組（空白組，C）、TPS低劑量干預組（25 mg/kg TPS，TL）、TPS中劑量干預組（5 0 m g/k g T P S，T M）、T P S高劑量干預組（100 mg/kg TPS，TH）。

每日定時進行灌胃處理，對照組灌胃生理鹽水，其余3 組行不同劑量TPS干預，連續灌胃21 d。在整個實驗周期內，每天觀察小鼠基本狀況并記錄體質量。

小鼠在實驗結束前12 h禁食，頸椎脫臼法處死小鼠，無菌收集小鼠腹腔巨噬細胞并置于細胞培養箱內培養。摘除小鼠脾臟和胸腺并稱質量。獲取小鼠腸道并收集腸道內容物，將盲腸內容物與結腸內容物分別收集并保存；小鼠腸道內容物與腸道組織標本置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 免疫器官指數測定

據小鼠解剖前體、脾臟和胸腺的質量，按式（1）、（2）計算其胸腺指數和脾指數，用于推斷TPS對小鼠免疫調節作用的影響[17]。

式中：m1為動物脾臟質量/g；m2為動物解剖前體質量/g；m3為動物胸腺質量/g。

1.3.3 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力測定

1.3.3.1 小鼠腹腔巨噬細胞培養

頸椎脫臼法處死小鼠后，無菌收集小鼠腹腔巨噬細胞[18]，腹腔注射無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），輕揉小鼠腹部，微量移液器收集細胞懸液，離心后棄上清液，重懸于RPMI1640完全培養基中，置于37 ℃孵箱進行細胞培養。

1.3.3.2 中性紅吞噬實驗

腹腔巨噬細胞接種于96 孔板，以腹腔巨噬細胞作對照組，用1μg/mL的LPS刺激腹腔巨噬細胞為實驗組，空白組未接種腹腔巨噬細胞，培養24 h后，棄細胞培養液，加入0.1%中性紅溶液100 μL/孔，培養3 h后以溫PBS洗3 次后，加入細胞裂解液200 μL/孔，靜置30 min，酶標儀測定每孔吸光度，以A540nm記錄并按式（3）計算吞噬指數[19]。每組樣品重復測試3 次。

式中：A1為實驗組吸光度；A3為對照組吸光度；A2為空白組吸光度。

1.3.4 結腸內容物中總SCFAs濃度測定

GC法測定總SCFAs濃度[20]，結腸內容物與超純水按質量-體積比1∶9經渦旋超聲混勻，上清液經0.22 μm濾膜過濾，進行總SCFAs濃度測定。各標準分析物按不同濃度范圍設定濃度梯度，并以其色譜峰面積制作標準曲線，計算結腸內容物中總SCFAs濃度。

色譜分析采用Agilent 6890 N氣相色譜和HP-INNOWAX色譜柱進行。GC分析條件：FID；載氣：N2；分流比：1∶1；N2流速：19.0 mL/min，空氣流速：300 mL/min， H2流速：30 mL/min；檢測器溫度：240 ℃，進樣口溫度：240 ℃；升溫程序：0.5 min升到100 ℃后，4 ℃/min升到180 ℃。樣品進樣量：0.2 μL。每次測定時間為20.5 min。每組樣品重復測試3次。

1.3.5 結腸內容物氨類物質含量、結腸pH值、含水量測定

采用靛酚藍比色法[21]測定結腸內容物氨含量，以A630nm為橫坐標，氨濃度為縱坐標繪制標準曲線后，測定結腸內容物樣液吸光度，根據結腸內容物質量、稀釋倍數等換算關系計算糞便樣品中的氨含量，以μmol/g糞便表示。每組樣品重復實驗3 次。

結腸內容物用蒸餾水以1∶9（m/V）的比例稀釋，取上清液測定pH值。結腸內容物稱質量后，置于（105±2） ℃的烘箱內干燥至恒質量并稱質量記錄[22]，質量差值是結腸內容物含水量（恒質量法）。每組樣品重復測試3 次。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 實驗周期內小鼠狀態

圖1 不同劑量TPS干預后小鼠體質量（n=12）Fig. 1 Body weights in mice administered with different concentrations of TPS (n = 12)

在整個實驗周期內，小鼠健康狀態良好，沒有出現死亡或疾病情況，也未觀測到活動和行為的改變。同時TL、TM、TH組小鼠與C組小鼠在外觀上沒有明顯差異。由圖1可知，實驗周期內C、TL、TM、TH組小鼠體質量無明顯差異，且沒有出現個別小鼠體質量驟減的情況。

2.2 免疫器官指數

表1 不同劑量TPS干預后小鼠免疫器官指數（n=12）Table 1 Immune organ indices of mice administered with different concentrations of TPS (n= 12)

由表1可知，TL、TM、TH組小鼠免疫器官指數均較C組小鼠免疫器官指數明顯增大，并呈劑量依賴關系，具有統計學意義（P＜0.05），表明灌胃TPS對小鼠免疫器官指數有積極影響。

2.3 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力

表2 不同劑量TPS干預后小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力（n=12）Table 2 Phagocytosis of peritoneal macrophages in mice administered with different concentrations of TPS (n= 12)

由表2可知，TL、TM、TH組的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力均較C組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力明顯增強，并呈劑量依賴性，具有統計學意義（P＜0.05），表明灌胃高、中、低劑量TPS對小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力有積極影響。

2.4 結腸內容物中總SCFAs濃度

圖2 不同濃度TPS干預后小鼠結腸內容物中總SCFAs濃度（n =12）Fig. 2 Total SCFA concentrations in colonic contents of mice administered with different concentrations of TPS (n = 12)

由圖2可知，TL、TM、TH組小鼠均較C組總SCFAs濃度明顯增大，并呈劑量依賴關系，具有統計學意義（P＜0.05），表明灌胃茶多糖對小鼠總SCFAs的生成有積極影響。

=12）Fig. 3 The concentrations of acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, valeric acid, isovaleric acid in colonic contents of mice in TPS treatment groups and control group (n = 12）圖3 TPS干預組與空白組結腸內容物中SCFA成分含量（n

TPS干預組與空白組結腸內容物中SCFA成分含量由圖3可知，TL、TM、TH組的乙酸含量明顯高于C組，并呈劑量依賴關系，具有統計學意義（P＜0.05），表明灌胃茶多糖對小鼠乙酸的生成有積極影響。

TM、TH組結腸內容物中丙酸、正丁酸含量均明顯高于C組（P＜0.05），并呈劑量依賴關系。TL組小鼠結腸內容物中丙酸、正丁酸含量高于C組小鼠結腸內容物中丙酸、正丁酸含量但無顯著性差別（P＞0.05）。

TL、TM、TH組結腸內容物中異丁酸、正戊酸含量與C組的含量沒有明顯差異（P＞0.05）。不同劑量TPS干預組的異戊酸含量均較C組的高，TH組小鼠結腸內容物中異戊酸含量明顯高于C組（P＜0.05），TM、TL組小鼠結腸內容物中異戊酸含量高于C組但無顯著性差異（P＞0.05）。結腸內容物中主要的SCFA是乙酸、丙酸和丁酸，約占總SCFAs含量的90%～95%[23]，而結果發現這3 種SCFA的含量均升高，總SCFAs含量明顯上升，提示TPS可促進SCFAs的產生。

2.5 結腸內容物中氨類物質含量、結腸pH值、含水量

紫外分光光度儀測量系列濃度梯度氨標準溶液濃度，以A630nm為橫坐標，各吸光度對應的氨濃度為縱坐標，求得回歸方程y=75.991x，相關系數為0.998。此結果說明靛酚藍比色法測得的氨含量標準曲線在標準溶液質量濃度范圍內（0.5～4.0 μg/mL，換算為氨濃度則為22.8～222.2 μmol/L），氨含量（y）和A630nm（x）相關性良好，該標準曲線可用于待測氨含量計算。

表3 不同劑量TPS干預后小鼠結腸內容物中氨含量、pH值、含水量（n=12）Table 3 Ammonia content, pH and water content in colonic contents of mice administered with different concentrations of TPS (n= 12)

由表3可知，TL、TM組結腸內容物氨含量均顯著低于C組（P＜0.05），表明低劑量TPS與中劑量TPS干預可明顯降低氨類物質含量。TH組與C組相比，小鼠結腸內容物氨含量極顯著降低（P＜0.01），表明高劑量TPS干預能顯著降低腸道內氨類物質的含量。腸道內氨含量的降低有助于人體腸道健康，因此TPS對維持腸道健康具有一定的作用。

TL、TM、TH組小鼠結腸內容物的pH值較C組均顯著降低（P＜0.05），并呈劑量依賴關系。表明不同劑量TPS干預均能顯著地降低腸道pH值。pH值的降低能降低結腸癌等結腸類疾病發生的幾率，因此TPS對小鼠腸道健康有積極影響。

TL、TM、TH組小鼠結腸內容物的含水量較C組均顯著增加（P＜0.05），并呈劑量依賴關系，表明高劑量TPS與中劑量TPS能顯著地影響結腸內容物含水量。該結果提示TPS的攝入可使結腸內容物具有更強的持水力，形成松弛的糞便，有利于腸道健康。

3 討 論

哺乳類動物的脾臟和胸腺是重要的免疫器官[24]，其臟器指數在一定程度上可反映機體免疫功能的強弱。巨噬細胞作為人體免疫系統的第一道屏障，對侵入人體的外來病原微生物具有極強的吞噬能力還能夠清除自身衰老和凋亡細胞[25-26]。本實驗研究結果顯示，經TPS干預后，正常C57/BL6小鼠器官指數顯著升高，巨噬細胞吞噬能力明顯增強，提示TPS可增強小鼠非特異性免疫調節功能。

SCFAs與氨類物質均為碳水化合物在結腸內被腸道菌群發酵的主要產物。近期研究發現，SCFAs在腸道方面不僅可氧化以供能，還可維持電解質平衡、腸道菌群平衡、調節腸道功能、提高機體免疫等[27-28]。膳食纖維在腸道內發酵的主要代謝產物是乙酸，生物體內大部分乙酸會被吸收入血液，參與肝臟代謝，為組織器官生命活動提供能量。丙酸、丁酸可減少體內胰島素的合成，間接減少膽固醇的合成[14]。結腸內容物中主要的SCFA是乙酸、丙酸和丁酸，約占 SCFAs 總量的90%～95%[23]，而結果發現這3 種SCFA的含量均升高，總SCFAs含量明顯上升，提示TPS可促進SCFAs的產生。而氨是某些菌群成員發酵內源性蛋白和尿素的產物，也是大部分腸道菌群的氮源物質。Wutzke等[29]認為腸道菌群對SCFAs和氨的調節可以營造更利于其生長繁殖的環境條件，這三者之間必然存在著相互聯系。Sakata等[30]認為，腸道內SCFAs濃度增加引起酸度上升，可以促進以氨為氮源的腸道菌群對氨的利用，從而引起氨濃度降低。結腸內容物含水量的升高使其具有更強的持水力，形成松弛的糞便，有利于腸道健康。本研究顯示，給予正常小鼠高中低劑量TPS干預后，正常小鼠腸道中SCFAs含量增加的同時，pH值降低，氨含量下降，內容物含水量升高。提示TPS干預有利于小鼠腸道健康。

綜上所述，經TPS干預的小鼠器官指數明顯升高，巨噬細胞吞噬能力明顯增強，結腸內氨類物質含量、pH值均明顯降低，結腸內容物含水量升高，結腸內的部分SCFAs（乙酸、丙酸、正丁酸）含量明顯升高。提示TPS可增強機體的免疫調節能力且對維護腸道健康具有明顯作用。

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Effects of Green Tea Polysaccharides on Intestinal Health and Immune Regulation in Mice

LI Haishan, LIU Liqiao, NIE Shaoping*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The objective of this work was to evaluate the effect of tea polysaccharides (TPS, from Wuyuan green tea) on intestinal health and immune regulation in mice. Healthy C57/BL6 mice were randomly divided into four groups, and they were administrated by gavage with different concentrations of tea polysaccharides. After adaptive feeding for one week, the animals in these groups were given high, mediumand low doses of TPS and normal saline as blank control for 21 days, respectively. At the end of the experimental period, the mice were sacrif i ced, and spleen and thymus were harvested and weighted to calculate immune organ indexes. Peritoneal macrophages were used to examine phagocytosis activity by using neutral red phagocytosis assay. Short chain fatty acids (SCFAs) in colonic contents were analyzed by gas chromatography (GC) and ammonia by the indophenol blue colorimetric method. Meanwhile, the pH and water content of colonic contents were also measured. Results showed that immune organ indexes were increased signif i cantly after TPS administration. The phagocytosis of peritoneal macrophages was improved in a dose-dependent manner. Some SCFAs (acetic acid, propionic acid and butyric acid) were increased while no difference in isobutyrate, pentanoic acid and delphinic acid was detected. A signif i cant decline in the ammonia content and pH of colonic contents of mice was observed, while water content increased. Therefore, TPS can regulate immune function and promote intestinal health in mice.

tea polysaccharides; immune regulation; intestinal health

10.7506/spkx1002-6630-201707030

TS201.4

A

1002-6630（2017）07-0187-06

李海珊, 劉麗喬, 聶少平. 茶多糖對小鼠腸道健康及免疫調節功能的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(7): 187-192.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707030. http://www.spkx.net.cn

LI Haishan, LIU Liqiao, NIE Shaoping. Effects of green tea polysaccharides on intestinal health and immune regulation in mice[J]. Food Science, 2017, 38(7): 187-192. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707030. http://www.spkx.net.cn

2016-06-28

國家自然科學基金優秀青年科學基金項目（31422042）

李海珊（1994—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學與工程。E-mail：lihaishan1112@163.com

*通信作者：聶少平（1978—），男，教授，博士，研究方向為食品化學、食品營養與安全。E-mail：spnie@ncu.edu.cn