香青菜揮發油提取及化學成分和抑菌活性研究

王桃云蔣偉娜胡翠英李 倩沈雪林呂海超（蘇州科技學院化學生物與材料工程學院，蘇州 5009）（蘇州市種子管理站，蘇州 50）

香青菜揮發油提取及化學成分和抑菌活性研究

王桃云1蔣偉娜1胡翠英1李 倩1沈雪林2呂海超1
（蘇州科技學院化學生物與材料工程學院1，蘇州 215009）
（蘇州市種子管理站2，蘇州 215011）

為了研究香青菜揮發油的提取工藝、化學成分及其抑菌活性，本試驗通過超聲波輔助回流萃取法對香青菜揮發油進行提取，在單因素試驗基礎上利用響應面法優化提取工藝條件。然后采用氣相色譜-質譜聯用分析揮發油化學成分。最后運用抑菌圈法研究香青菜揮發油的抑菌效果。結果表明，所得的最優工藝條件為：超聲波功率378 W、提取時間50 min、液料比26.5∶1（mL／g）、提取溫度62℃，在此條件下揮發油的得率為2.43%。在香青菜揮發油中鑒定出46種化合物，其主要成分為亞麻酸甲酯（14.76%）、3-苯基丙腈（12.18%）、鄰苯二甲酸二丁酯（10.34%）、鄰苯二甲酸二乙酯（9.74%）、棕櫚酸（7.12%）等。同時最優條件下提取的香青菜揮發油對受試菌種都有一定的抑菌活性，對大腸桿菌的抑菌活性最強，其MIC值為0.625 mg／mL。該研究為香青菜揮發油在食品和藥品方面的進一步研究與應用提供了理論基礎。

響應面 優化 超聲波提取 香青菜 揮發油 化學成分 抑菌活性

植物揮發油是從植物的根、莖、葉、花或果實中提取出來的的揮發性芳香物質。揮發油不僅具有芳香氣味，同時具有抗菌殺蟲、抗腫瘤、抗氧化等生物活性，并有提供人體細胞營養，調動中樞神經系統等功效。因此有關植物揮發油的研究已越來越受到廣大研究者的重視［1-2］。

香青菜是蘇州地方傳統特色珍稀蔬菜品種，其栽培史距今已有100多年。它是蘇州市第一個申報農產品地理標志的蔬菜品種，主要分布在沿太湖及太湖西南岸的部分地區［3-4］。香青菜最大的特點是炒熟后有特殊的濃郁香味，并由此得名［4］。目前，有關香青菜研究主要集中在香青菜的特征特性、常規栽培技術與品種選育工作。而有關香青菜濃郁香味的來源—香青菜揮發油的研究，現在還是一片空白，從而導致有關香青菜的具體營養成分含量及生物活性功能不明確，嚴重制約了香青菜產業的發展［3-4］。本研究通過優化香青菜揮發油提取工藝，分析香青菜揮發油化學成分，并對其抗菌作用進行科學評價，為促進香青菜揮發油在食品、藥品生產中應用，增加農民收入提供理論基礎，同時也有助于進一步保護和利用好蘇州香青菜這種優質種質資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

取12月下旬采自蘇州市吳江震澤鎮蔬菜生產基地的香青菜，并由蘇州市種子管理站沈雪林高級農藝師鑒定為“黃種香青菜”。香青菜去根后用蒸餾水洗凈，在35℃下烘干并粉碎后過60目篩后密封儲于棕色瓶中，備用。

石油醚（沸程60～90℃）、二甲基亞砜、山梨酸鉀等均為的分析純；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和灰綠青霉（Penicillium-glaucum）保存于蘇州科技學院化生材料工程學院微生物實驗室。

1.2 主要儀器設備

SCION SQ GC-MS：美國 Bruker公司；SB-600GDV超聲波恒溫清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2450紫外-可見光分光光度計：島津儀器有限公司；EYELA N-1100S-W型旋轉蒸發儀：東京理化器械株式會社；GL-21M高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機有限公司；MCV-91BNS（T）超凈工作臺：三洋電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 香青菜揮發油提取分離的基本工藝流程

本試驗香青菜揮發油的提取是采用溶劑萃取法；香青菜揮發油得率計算式為：揮發油得率=（揮發油質量／香青菜原料質量）×100%

1.3.2 單因素試驗

考察超聲波功率、提取時間、液料比和提取溫度這4個因素對香青菜揮發油提取量的影響，每個因素取5個水平。

1.3.3 響應面優化試驗

根據本試驗單因素試驗結果，參考Hammi等［5］和Yuan等［6］的方法，以超聲波功率（A）、提取時間（B）、液料比（C）和提取溫度（D）為自變量，香青菜揮發油得率（Y）為響應值，根據Box-Behnken的中心組合設計原理，設計了四因素三水平響應面試驗設計表，如表1所示。

表1 響應面分析中心組合試驗設計表

1.3.4 香青菜揮發油成分的GC-MS分析

氣相色譜條件：色譜柱，DB-wax（30 m×0.25 mm×0.25 um）石英毛細管色譜柱；進樣口溫度：250℃；程序升溫：起始溫度40℃，保持3 min，以升溫速率5℃／min，升溫到90℃，再以升溫速率10℃／min升溫到230℃，保持8 min；載氣：氦氣，流速：0.8 mL／min，不分流。

質譜條件：電離方式為EI，電子能量為70 eV；離子源溫度：200℃；接口溫度：250℃；質量掃描范圍：33～400；檢測器電壓1 000 V。

1.3.5 香青菜揮發油的抑菌試驗

1.3.5.1 培養基制備

分別制備牛肉膏蛋白胨培養基（NB培養基）和馬鈴薯固體培養基（PDA培養基）［7-8］。

1.3.5.2 菌種的活化和菌懸液的制備［9］

將4℃冰箱中保藏的試驗所用菌株取出置于常溫下解凍60 min，然后采用劃線法接種于平板上，細菌37℃培養24 h，真菌28℃培養48 h后，挑選典型菌落接種于液體培養基中，在適宜溫度下（細菌37℃、真菌28℃），120 r／min恒溫震蕩培養，待液體培養基變渾濁后，用無菌生理鹽水配制成含菌量為106～107CFU／mL的菌懸液，備用。

1.3.5.3 抑菌活性測定［10］

采用抑菌圈法測定抑菌活性。將直徑為6 mm小圓濾紙片高壓滅菌后在不同濃度的香青菜揮發油中浸泡20 min，以二甲基亞砜為陰性對照。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在37℃恒溫培養24 h，灰綠青霉在28℃恒溫培養48 h，每組試驗設3個重復，用十字交叉法測定抑菌圈直徑大小，結果取3次重復試驗的平均值。

1.3.5.4 最小抑菌濃度（MIC）的測定

采用二倍稀釋法將香青菜揮發油配制一系列梯度濃度為：100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78 mg／mL的溶液。然后參照Orlanda等［11］的方法，觀察各平板抑菌圈的有無，首次沒有出現菌株生長的藥物平板濃度即為最低抑菌濃度。

1.3.6 數據處理

所有數據均為3次重復試驗的平均值，應用Microsoft Excel 2010、SPSS 19.0、Design-Expert.V8.0.6對數據進行處理、分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲波功率對揮發油得率的影響

在液料比15∶1、超聲時間20 min、溫度50℃的基礎條件下，考察不同的超聲功率（100、200、300、400、500 W）對香青菜揮發油提取量的影響，結果見圖1中的超聲波功率對揮發油影響曲線。

如圖1所示，隨著超聲功率的增強，揮發油得率不斷增加，因為功率越大，對細胞的破壞作用越強，提取劑擴散速度也越快，從而有利于揮發油的萃出，當超聲功率達300 W時，揮發油得率達最高值，繼續提高超聲波功率，揮發油得率趨于穩定并有所下降，可能是由于過高的提取功率使提取液振動加速，產生的空化作用使空化氣泡閉合過快，細胞破碎作用隨之減弱，從而導致揮發油得率降低［12］。因此，超聲波功率選擇200～400 W較好。

2.1.2 提取時間對揮發油得率的影響

在液料比15∶1、超聲功率為300 W、溫度50℃的基礎條件下，考察不同的提取時間（10、20、30、40、50 min）對香青菜揮發油提取量的影響，結果見圖1中的提取時間對揮發油得率影響曲線。

由圖1可知，在10～40 min時，揮發油得率隨著提取時間的增加而提高，隨后得率趨于穩定并有所下降。其原因可能是隨著提取時間的增加，在超聲波作用下香青菜細胞破碎度逐漸增大，揮發油萃出量逐漸增加；但隨著提取時間繼續加長，則會使細胞碎片過多，同時各種雜質溶出物也增多，從而導致揮發油得率下降［13］。因此，提取時間宜在30～50 min比較合適。

2.1.3 液料比對揮發油得率的影響

在提取時間為20 min、超聲功率300 W、溫度為50℃的基礎條件下，考察不同的液料比（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL／g對香青菜揮發油提取量的影響，結果見圖1中的液料比對揮發油得率的影響曲線。

由圖1所示，液料比在15∶1～25∶1之間時，揮發油得率隨著液料比的增大而升高，這是因為隨著液料比的增加，增加了原料與提取劑間的濃度差，有利于揮發油成分的萃出。當液料比大于25∶1之后，隨著液料比的增大揮發油得率趨于穩定并有所下降，這可能是因為液料比增加到一定程度后原料與提取劑之間已經達到平衡，同時溶劑量增大到一定程度后，會使超聲波空化作用相對減弱，從而使得油率下降［12，14］。因此液料比以在20～30 mL／g之間為宜。

2.1.4 提取溫度對揮發油得率的影響

在提取時間為20 min、超聲功率300 W、液料比為15∶1 mL／g的基礎條件下，考察不同的提取溫度（40、50、60、70、80℃）對香青菜揮發油提取量的影響，結果見圖1中的提取溫度對揮發油得率的影響曲線。

由圖1所示，提取溫度在40～60℃之間時，揮發油得率隨著溫度升高而增大，這是因為隨著溫度升高，降低了液體黏度，增加了物質的傳質速度，有利于揮發油成分的萃出［15］。但溫度超過60℃時，隨著溫度升高，就越接近石油醚的沸點，使得溶劑的揮發不斷加快，這樣就減少了提取劑與原料的有效接觸，導致揮發油萃出率降低［16］。因此提取溫度在50～70℃之間為宜。

超聲波功率、提取時間、液料比和提取溫度揮發油得率影響結果見圖1。

圖1 不同因素對香青菜揮發油得率的影響

2.2 響應面試驗優化香青菜揮發油提取工藝

2.2.1 響應面試驗設計與結果

在單因素試驗的基礎上，以香青菜揮發油得率為指標，按照表1的試驗設計表進行四因素三水平29組試驗的響應面分析試驗，響應面試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

2.2.2 模型的建立與方差分析

根據Box-Behnken中心組合設計原理，利用Design-Expert.V8.0.6軟件對表2中的試驗結果進行多元回歸擬合，可得超聲波功率、提取時間、液料比和提取溫度與香青菜揮發油得率之間相互關系的二次多元回歸方程：

Y=2.33-0.006 167A+0.14B+0.042C-0.022D+ 0.095AB+0.034AC-0.043AD-0.007 275BC+ 0.087BD+0.043CD-0.058A2-0.055B2-0.12C2-0.14D2

式中：A、B、C、D的各項系數的絕對值大小直接反映出各因素對香青菜揮發油得率的影響程度，系數的正負反映出香青菜揮發油得率增加或減小。對表2中的試驗結果進行統計分析，分析結果如表3所示。

表3 回歸模型方差分析表

由表3可知，模型中一次項中提取時間對方程影響最顯著，說明提取時間直接關系到香青菜揮發油的得率；二次項中的提取溫度和提取時間均對香青菜揮發油得率有顯著影響，且其影響呈二次關系。由F值可知，各因素對香青菜揮發油得率的影響次序為：提取時間＞液料比＞提取溫度＞超聲波功率。整體模型的P＞F值小于0.01，表明該回歸模型達到極顯著水平；回歸模型的相關系數R2=0.916 4，且失擬項不顯著（P＞F值為0.293 3，大于0.05），說明模型與數據之間擬合度較好，因此可以用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。

2.2.3 各因素間的交互作用分析

響應面各因素交互作用圖的形狀直接反映出交互作用的強弱，圓形表明交互作用不顯著，而橢圓形則表示交互作用顯著，有閉合的橢圓或圓形則表明有極大值。通過響應面交互作用圖可知，超聲功率與提取時間的交互效應最為顯著，其對香青菜揮發油得率影響也很大；提取時間和提取溫度的交互作用也是很強的，其對香青菜揮發油得率影響也較大。其他幾組因素之間的交互作用較小，它們對香青菜揮發油得率影響也較?。?7］。這也與表3回歸模型方差分析的結果是一致的。

2.2.4 回歸模型的優化與驗證

在試驗范圍內，通過Design-Expert.V8.0.6軟件對試驗結果進行優化分析，得出香青菜揮發油的最優提取條件為：超聲波功率為378.4 W，提取時間為50 min，液料比為26.4 mL／g，提取溫度為61.6℃。考慮到試驗的可操作性，將工藝條件修正為：超聲波功率為 378 W，提取時間為 50 min，液料比為26.5 mL／g，提取溫度為62℃。在此工藝條件下，香青菜揮發油得率的平均值為2.43%，與預測得率（模型預測得率為2.46%）的誤差為1.2%說明了回歸方程的預測值與試驗值之間具有較好的擬合度。因此，基于響應面法所得的優化工藝參數準確可靠，可用于指導生產實踐。

2.3 香青菜揮發油的GC-MS分析

香青菜揮發油GC-MS檢測所得質譜圖經計算機質譜NIST譜庫檢索，并按各峰的質譜裂片圖與文獻資料比對，確定香青菜揮發油的主要化學成分，并采用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量，結果見表4。

表4的分析鑒定結果表明，香青菜揮發油主要化學成分為脂肪族、芳香族和萜類3大類化合物以及它們的含氧衍生物，如醇、醛、酮、酸、醚、酯、內酯等，從香青菜揮發油中共檢測出49個色譜峰，初步鑒定了46個化合物，被鑒定化合物相對含量占揮發油總量的99.24%。其中主要化合物為亞麻酸甲酯（14.76%）、3-苯基丙腈（12.18%）、鄰苯二甲酸二丁酯（10.34%）、鄰苯二甲酸二乙酯（9.74%）、棕櫚酸（7.12%）、3-戊烯腈（4.18%）、二甲基三硫（3.97%）、α-亞麻酸甲酯（3.85%）、異硫氰酸-3-丁烯-1-基酯（3.15%）等。其中亞麻酸甲酯、3-苯基丙腈、棕櫚酸、3-戊烯腈、α-亞麻酸甲酯、異硫氰酸-3-丁烯-1-基酯等都是各種植物中揮發油或香料中的主要香氣成分。而香青菜揮發油中的主要成分鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯和二甲基二硫具有一定的殺蟲抗菌作用。

表4 香青菜揮發油GC-MS分析結果

采用GC-MS聯用技術，對優化條件下提取的香青菜揮發油進行分離分析，得到香青菜揮發油的總離子流圖，如圖2所示。

圖2 香青菜揮發油總離子流色譜圖

2.4 香青菜揮發油的抑菌試驗

2.4.1 抑菌作用測定

按照1.3.5的方法進行抑菌試驗，試驗結果見表5。

表5 香青菜揮發油對受試菌的抑菌活性

由表5可知，香青菜揮發油對對各受試菌種均有較強的抑菌活性，且香青菜揮發油對幾種受試細菌的抑菌活性要強于對受試真菌的抑菌活性。

2.4.2 香青菜揮發油最小抑菌濃度測定

按照1.3.5.4的方法進行最小抑菌濃度試驗，試驗結果見表6。

表6 香青菜揮發油對受試菌的最小抑菌濃度

由表6結果可知，從對受試菌種抑制作用的MIC值來考慮，香青菜揮發油對3種受試菌的抑制強度依次為：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌=枯草芽孢桿菌。

從以上結果可知，香青菜揮發油具有較好的抗菌、殺菌活性，結合前面對于香青菜揮發油的成分分析，初步可以推斷香青菜揮發油中起到抑菌作用的活性成分主要是鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯和二甲基二硫等。

3 結論

本試驗采用超聲波輔助提取香青菜中的揮發油，在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken設計原理采用四因素三水平響應面分析方法，考察超聲功率、液料比、提取時間和提取溫度對香青菜揮發油得率的影響，得到提取香青菜揮發油的最優工藝條件：超聲波功率378 W，提取時間為50 min，液料比為26.5∶1 mL／g，提取溫度為62℃，在此工藝條件下香青菜揮發油的得率可達2.43%。

采用GC-MS聯用法對優化工藝條件下提取得到的香青菜揮發油的化學成分進行了分離鑒定，共檢測出49個色譜峰，初步鑒定了46個化合物，被鑒定化合物相對含量占揮發油總量的99.24%。檢出成分主要是亞麻酸甲酯、3-苯基丙腈、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯、棕櫚酸等，其總量達所檢測到的化學成分的53.7%，這些成分都是各種植物中揮發油或香料中的主要香氣成分，其中部分化合物具有殺蟲和抗菌活性。

本研究還對優化工藝下提取的揮發油的抗菌活性進行了測定，結果表明香青菜揮發油具有較好的抗菌活性，結合前面GC-MS檢測結果，初步推斷香青菜揮發油中起到抑菌作用的主要活性成分是鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯和二甲基二硫。

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Research on Extraction，Chemical Composition and Bacterial Inhibition Activity of Volatile Oils from Brassica Chinensis

Wang Taoyun1Jiang Weina1Hu Cuiying1Li Qian1Shen Xuelin2Lü Haichao1
（College of Biochemistry and Material Engineering，Suzhou University of Science and Technology1，Suzhou 215009）（Suzhou Station of Seed Management2，Suzhou 215011）

To study extraction technology，chemical composition and antibacterial activity of volatile oils from brassica chinensis，in this experiment，volatile oils from brassica chinensis were extracted by virtue of ultrasonic-assisted reflux extraction method，and response surface methodology was used to optimize extraction technology conditions based on single-factor experiments.The chemical composition of volatile oils was analyzed by GC-MS and antibacterial effect of volatile oils from brassica chinensis was researched by inhibition zone method finnaly.The results indicated that the optimal technology conditions obtained were as follows：ultrasonic power of 378 W，extraction time of 50min，ratio of material and solution of 26.5∶1（mL／g）and extraction temperature 62℃.On this condition，the yield of volatile oils was 2.43%.Additionally，a total of 46 compounds were identified and the main compounds were methyl linolenate（14.76%），3-phenyl propionitrile（12.18%），dibutyl phthalate（10.34%），diethyl phthalate（9.74%），palmitic acid（7.12%），etc.Besides，volatile oils from brassica chinensis，extracted on the optimal condition had a certain bacteriostatic activity on the tested bacterial species.And it had the strongest bacteriostatic activity on escherichia coli，with the minimum inhibitory concentration（MIC）for escherichia coli being 0.625 mg／mL.These may further provide theoretical basis for further research and application of volatile oils from brassica chinensis，in food and medicine products.

response surface methodology，optimization，ultrasonic extraction，volatile oils from Brassica Chinensis，chemical composition，bacteriostatic activity

TS201.2

A

1003-0174（2017）03-0081-07

蘇州科技計劃（SYN201322），蘇州市科技局基礎類研究（SZP201313）

2015-08-14

王桃云，男，1973年出生，副教授，植物資源與食品功能成分

沈雪林，男，1975年出生，高級農藝師，蔬菜及種子