利用月桂酸和山茶油的酸解反應(yīng)分析脂肪酶的位置專一性

曹 茜韋 偉張 希馮鳳琴（浙江大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系；浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點實驗室，杭州 30058）（云南中醫(yī)學(xué)院，昆明 650500）

利用月桂酸和山茶油的酸解反應(yīng)分析脂肪酶的位置專一性

曹 茜1韋 偉1張 希2馮鳳琴1
（浙江大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系；浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點實驗室1，杭州 310058）（云南中醫(yī)學(xué)院2，昆明 650500）

脂肪酶的位置專一性在結(jié)構(gòu)酯的合成和油脂改性中具有重要意義。由于水體系和非水體系的差異，傳統(tǒng)的水解判定法得出的專一性與該酶在合成反應(yīng)中的表現(xiàn)可能并不一致。本研究利用月桂酸和山茶油的酸解反應(yīng)來達到直接評估酶在無溶劑體系中位置專一性的目的。反應(yīng)產(chǎn)物的脂肪酸組成和位置分布由氣相色譜測定。通過此方法，Lipozyme RM IM、L02、L03和L04被鑒定為sn-1（3）位專一性，L01為弱專一性，Novozym 435近似無專一性。通過替換酶的底物，模型反應(yīng)的可預(yù)測性得到驗證。根據(jù)酸解法和水解法結(jié)果的對比分析，2種條件下酶的位置專一性通常是相同的，除了易受到溶劑體系影響的Novozym 435。因此，新方法能夠避免水解判定結(jié)果在合成反應(yīng)中應(yīng)用的局限性。此外，它還降低了對底物純度的要求，這意味著其能在低成本下用于脂肪酶的大規(guī)模篩選。

脂肪酶 位置專一性 山茶油 酸解 合成

脂肪酶（EC 3.1.1.3）能夠催化甘油三酯的水解，并釋放出游離脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯和甘油。事實上，由于脂肪酶能夠在無水體系中催化合成反應(yīng)，包括酯化、酯交換、酸解、醇解和氨解等［1-2］，因而其底物種類進一步增加。受益于底物和反應(yīng)種類的多樣性，脂肪酶已被廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域，例如食品、飼料、藥品、化妝品、洗滌劑等。此外，一些新興的應(yīng)用，特別是生產(chǎn)生物柴油和處理廢水，也引起了研究者的關(guān)注［3-5］。然而，全能的脂肪酶幾乎是不存在的，根據(jù)實驗室和工業(yè)上特定的需求，一個合適的脂肪酶常常需要從大量的催化劑中篩選出來。篩選因子是多種多樣的，如最適pH值、最適溫度、位置專一性、立體專一性、金屬離子耐受性、有機溶劑耐受性、底物特異性等均會深刻地影響脂肪酶的經(jīng)濟價值。

位置專一性是脂肪酶最重要的特性之一。專一性脂肪酶有2種類型：sn-1（3）位和sn-2位專一性［6］。南極假絲酵母（Candida antarctica）脂肪酶A被認為是唯一已知的對2位有反應(yīng)傾向性的脂肪酶［7］。無位置專一性脂肪酶，即對1（3）位和2位沒有選擇性的脂肪酶同樣存在。不同的結(jié)構(gòu)酯合成和油脂改性，例如母乳化結(jié)構(gòu)酯的合成和油脂中多不飽和脂肪酸的富集，對脂肪酶的位置專一性有不同的需求。因此，一個新型的脂肪酶的專一性在其應(yīng)用之前必須鑒定準確。

利用薄層色譜分析三油酸甘油酯的酶水解產(chǎn)物是最常見和傳統(tǒng)的專一性判定方法。根據(jù)此方法，由勞爾氏菌（Ralstonia sp.CS274）、3種芽孢桿菌（Bacillus isolates GK-8，GK-31 and GK-42）、假單胞菌（Pseudomonas sp.GK-80）、異孢鐮刀菌（Fusarium heterosporum）、土曲霉（Aspergillus terreus）、肉色曲霉（Aspergillus carneus）和鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）產(chǎn)生的脂肪酶為sn-1（3）位專一性［8-13］，而由鏈霉菌（Streptomyces sp.CS268）分泌的脂肪酶則無位置專一性［3］。由此方法分析所得結(jié)果顯然反映的是水解反應(yīng)中酶的位置專一性。然而，如上所述，脂肪酶催化的反應(yīng)不僅包括水解也包括合成反應(yīng)。并且，一些脂肪酶更適合于合成而非水解。由于水體系和非水體系的區(qū)別，在2種體系下脂肪酶的位置專一性可能出現(xiàn)不一致。因此，直接評估脂肪酶在合成反應(yīng)中位置專一性的方法需要被建立。本研究中，月桂酸和山茶油的酸解反應(yīng)被設(shè)定為模型反應(yīng)，利用氣相色譜測定反應(yīng)產(chǎn)物的脂肪酸構(gòu)成和位置分布，從而定量脂肪酶的位置專一性。因為本方法測定的是產(chǎn)物中脂肪酸的組成和分布而非甘油三酯的種類和構(gòu)成，所以反應(yīng)底物中甘油三酯的純度將不再是合成判定體系的限制性因素，這大大降低了反應(yīng)成本，使得此法能夠用于大規(guī)模篩選脂肪酶。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

脂肪酶Lipozyme RM IM、Novozym 435：諾維信公司；Lipozyme RM IM為固定在大孔陰離子交換樹脂上的米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）脂肪酶，Novozym 435為固定在大孔丙烯酸樹脂上的南極假絲酵母（Candida antarctica）脂肪酶B；非固定化脂肪酶L01、L02、L03、L04：深圳綠微康生物工程有限公司；L01和 L04分別產(chǎn)自擴展青霉（Penicillium expansum）和黑曲霉（Aspergillus niger）；L02和L03產(chǎn)自不同來源的米曲霉（Aspergillus oryzae）；脂肪酸甲酯混標（C4-C24）、1，2-二油酸甘油酯（純度≥98%）、1，3-二油酸甘油酯（純度≥99%）、1-單油酸甘油酯（純度≥99%）、Trizma?base（≥99.9%）和豬胰脂肪酶（typeⅡ）：Sigma-Aldrich有限公司；月桂酸甲酯：東京化工有限公司；山茶油：聯(lián)華華商集團有限公司；用于薄層色譜的預(yù)制硅膠板（GF254）和用于柱層析的300～400目硅膠：煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所；其他試劑為分析純。

1.2 分析無水體系中位置專一性和酶活力

1.2.1 酸解反應(yīng)

0.9 g月桂酸和1 g山茶油被選定為脂肪酶（0.1 g）的底物，月桂酸和山茶油的摩爾比為4∶1。酸解反應(yīng)在40～60℃水浴中進行，并同時用轉(zhuǎn)子攪拌。反應(yīng)結(jié)束后，加入4 mL氫氧化鉀水溶液（2 mol／L）和3 mL正己烷。氫氧化鉀能夠中和體系中的游離脂肪酸，并同時中止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物離心，待測的甘油酯位于上層。

1.2.2 氣相色譜分析

取2 mL稀釋20倍的上層液體，并加入200 μL氫氧化鉀甲醇溶液（2 mol／L）以完成甲酯化。由于天然山茶油中不含有月桂酸，因此月桂酸甲酯的含量就等同于通過酸解反應(yīng)結(jié)合到甘油骨架上的月桂酸的量。分析測定脂肪酸甲酯的檢測器為FID，氣相柱為DB-23（30 m×0.250 mm×0.25 μm， Agilent Technologies），檢測條件：進樣溫度250℃；分流比為50∶1；氮氣為載氣；檢測器溫度為300℃；柱溫50℃保持5 min，然后以10℃／min升至180℃，并在180℃保持5 min，最后以5℃／min升至230℃。

sn-2位脂肪酸的分析根據(jù)AOCS Official Method Ch 3-91并做了少量調(diào)整。1 mL上層液體中加入50 mg豬胰脂肪酶、2 mL Tris-HCl緩沖液（1 mol／L，pH=8.0）、500 μL膽酸鈉（1 g／L）和200 μL氯化鈣（220 g／L），酶水解反應(yīng)在40℃水浴中進行2 min，反應(yīng)過程中不斷振蕩。水解產(chǎn)物在薄層色譜板上分離之后刮取2-甘油單酯，并重溶于2 mL正己烷，其甲酯化和氣相測定方法如前所述。

1.2.3 計算公式

脂肪酶的位置專一性可以利用sn-1（3）位和sn-2位月桂酸的比值來定量。由于氣相色譜通過面積歸一化法可直接獲得總月桂酸和2位月桂酸的摩爾分數(shù)，因此位置專一性比值由式（1）和式（2）進行計算。理想狀態(tài)下，比值為1時，樣品為無位置選擇性；事實上，考慮到空間位阻效應(yīng)，當值接近于1時，酶可以被認為是無專一性。比值越高，脂肪酶的1 （3）位專一性則越強。若比值小于1，酶則有2位專一性的潛力。

1（3）位月桂酸摩爾分數(shù)=

此模型反應(yīng)同時還反映了脂肪酶在合成反應(yīng)中的酶活力，一個酶活力單位（U）被定義為標準反應(yīng)條件下，山茶油甘油骨架上每小時結(jié)合1%月桂酸所需的酶量。

1.3 分析水體系中位置專一性

1.3.1 制備三油酸甘油酯

山茶油經(jīng)硅膠柱層析分離后可制得三油酸甘油酯的粗品。移動相為正己烷／乙醚（7／3）。過柱2次以達到完全去除甘油二酯、甘油單酯和游離脂肪酸的目的。收集含甘油三酯的洗脫液，利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除溶劑。

1.3.2 三油酸甘油酯水解和薄層色譜分析

100 μL三油酸甘油酯、200 μL Tris-HCl緩沖液（0.05 mol／L，pH=7.0）和100 μL溶于緩沖液的酶樣加入到2 mL EP管中，在40℃和200 r／min振蕩條件下反應(yīng)1 h。水解產(chǎn)物用200 μL乙醚萃取，并于薄層色譜板上分離，移動相為正己烷／乙醚／甲酸（70／30／1）。利用碘蒸汽使硅膠板上各點顯色。

1.4 統(tǒng)計分析

所有試驗均做3次平行。相關(guān)數(shù)據(jù)由單因素方差分析進行處理，不同因素或組間的差異利用Duncan's multiplerange test（DMRT）檢驗。2個因素的非獨立樣本的差異性則由配對t檢驗分析。SPSS Statistics 17.0處理了所有的統(tǒng)計分析，P＜0.05被認為是具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 操作可行性

如表1所示，山茶油的主要成分為油酸，不含有月桂酸，它的3個位置上的高油酸含量能夠確保酶的位置專一性測定不會受到脂肪酸選擇性的影響。月桂酸的熔點為44.2℃，并且山茶油能在一定程度上溶解月桂酸，因此，反應(yīng)體系的液體狀態(tài)可以保持在44.2℃以下，而液體狀態(tài)對無溶劑體系的反應(yīng)是至關(guān)重要的。試驗表明，反應(yīng)混合物在40℃仍然工作良好。

表1 山茶油的脂肪酸組成和位置分布

Lipozyme RM IM已長期廣泛應(yīng)用于試驗研究和工業(yè)生產(chǎn)，因而選擇該酶來驗證方法的可行性。在選擇反應(yīng)條件時，溫度和時間必須納入考慮范圍。不同脂肪酶的最適反應(yīng)溫度可能不同，例如，畢赤酵母（Pichia lynferdii NRRL Y-7723）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和葡萄球菌（Staphylococcus sp.strain ESW）產(chǎn)脂肪酶分別為 40℃［14］、50～60℃［15］和70℃［16］。但若對一個未知的脂肪酶施以過高的溫度并不是明智的選擇。所以選定40～60℃和1～8 h作為測試條件。圖1為酸解產(chǎn)物甲酯化后氣相色譜測定的代表性譜圖（反應(yīng)由 Lipozyme RM IM在50℃催化進行2 h）。

圖1 酸解產(chǎn)物甲酯化后氣相色譜圖

圖2 Lipozyme RM IM催化下的酰基遷移酶活力和位置專一性

由于Lipozyme RM IM是一種普遍認可的sn-1 （3）位專一性脂肪酶，因此酰基遷移被認為是sn-2位結(jié)合上月桂酸的原因。圖2a表明酰基遷移與反應(yīng)時間和溫度相關(guān)。60℃時，遷移在前2 h處于低水平，接著便會急劇增加；與此情況相對應(yīng)的是位置專一性比值在2 h后快速下降（圖2c，60℃）。同樣的對應(yīng)性也發(fā)生在50℃的6 h后。所以，酰基遷移很可能是造成后期比值降低的原因。由于60℃會嚴重加劇遷移速率，因而除非是針對嗜熱菌，高溫條件并不推薦。相對短的反應(yīng)時間能夠最小化酰基遷移的影響，在40℃和50℃時，1%以下的酰基遷移能分別保持8 h和6 h。此外，隨著反應(yīng)的進行，底物的構(gòu)成將會逐漸發(fā)生改變，當游離月桂酸沒有處在過量狀態(tài)時，則可能會影響反應(yīng)模型的可靠性。如圖2b所示，酶催化活力在初期保持穩(wěn)定，之后則緩慢降低，這很可能源自游離月桂酸減少。經(jīng)單因素方差分析證明，4 h內(nèi)的酶活力為同類子集（P＞0.05）。在40℃和50℃下，4 h后的專一性比值出現(xiàn)了平臺期，說明底物改變的影響已開始出現(xiàn)。如果反應(yīng)效率和轉(zhuǎn)化率也納入到考慮范圍，為保證鑒定結(jié)果的可靠性，50℃和2～4 h是較好的反應(yīng)條件，特別是對于酶活力較低的脂肪酶，過短的反應(yīng)時間可能導(dǎo)致得出假1（3）位專一性的結(jié)果。但對于熱敏性脂肪酶，40℃當然更為適合。配對t檢驗表明，Lipozyme RM IM催化下，40和50℃的位置專一性比值在4h內(nèi)無顯著性差異。

為了檢驗此方法對專一性和非專一性脂肪酶是否能有效區(qū)分，試驗也分析了一個可能的無專一性脂肪酶 Novozym 435。由于其位置專一性比值為1.38到2.25（圖3），非常接近理論值1，因而被認定為近似非專一性。由圖3可知，50℃時Novozym 435的催化活力低于Lipozyme RM IM，但前者在10 h內(nèi)一直保持穩(wěn)定。這是因為，在酶活力相對低的反應(yīng)體系中，游離月桂酸的過量狀態(tài)能夠維持更長時間。也就是說，對于酸解酶活力低于Lipozyme RM IM的脂肪酶，4 h內(nèi)一定不會影響結(jié)果的可靠性。

圖3 50℃時Novozym 435的位置專一性和酶活力

2.2 線性

考慮到常用的酶和底物比，此方案中選擇0.1 g作為酶的添加量。但酶的催化活力和獲取難易都可能影響其添加量。因此0.05～0.25 g的Lipozyme RM IM，也就是2.6%～13.2%的酶和底物比，都被應(yīng)用到該方法中，以檢驗其線性。反應(yīng)在50℃下進行了2 h。由 OriginPro 8.5計算得出的 R2（圖 4a）為0.980 9，這表明總酶活和酶質(zhì)量具有明顯的線性相關(guān)，即單位質(zhì)量的酶活是常量。換句話說，在一定添加范圍內(nèi)，酶和底物比不會影響脂肪酶的分析。圖4b顯示了不同添加量對位置專一性比值的影響。由圖可知，在0.05、0.10和0.25 g 3組中不存在顯著性差異；雖然另2組中存在差異，但結(jié)論相同，即該脂肪酶為sn-1（3）位專一性。也就是說，不同的酶和底物比不會改變定性判斷，但可能會影響專一性的程度。

圖4 酶添加量對Lipozyme RM IM總酶活和位置專一性的影響

2.3 適用性和預(yù)測性

為了了解該方法的適用性和可預(yù)測性，另外4個樣品也被分析測定。表2表明，酸解法能夠適用于不同的脂肪酶。6種脂肪酶1和4 h酶活的配對t檢驗再次確認，4 h時模型反應(yīng)的底物構(gòu)成仍然適用于酶的分析（P＞0.05）。專一性比值顯示，L01為弱專一性，L02、L03和L04為sn-1（3）位專一性，且L04的專一性弱于L02和L03。

表2 合成反應(yīng)中脂肪酶的位置專一性和酶活

表3 不同底物反應(yīng)中sn-1和3位結(jié)合量占總結(jié)合量的百分比

在建立的檢測方案中，其中1種底物為山茶油，該油的主要成分油酸為單不飽和脂肪酸。飽和脂肪酸棕櫚酸在棕櫚油中含有（56.16±0.24）%，多不飽和脂肪酸二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）在魚油中的含量分別為（18.34±0.20）%和（12.22±0.17）%。利用棕櫚油和魚油分別替代山茶油可以達到檢驗該方法預(yù)測性的目的。測定結(jié)果見表3。配對t檢驗證明棕櫚油組和魚油組的差異不顯著。組內(nèi)數(shù)據(jù)的單因素方差分析表明，由模型反應(yīng)判定的脂肪酶能夠被用于其他甘油酯作為底物的反應(yīng)，且它們的位置專一性是可預(yù)見的。此外，癸酸和肉豆蔻酸也分別取代模型反應(yīng)底物中的月桂酸來進一步驗證，得出的位置專一性與表2的結(jié)論是一致的，癸酸組和肉豆蔻酸組的差異也是不顯著的。簡言之，雖然模型反應(yīng)的底物為山茶油和月桂酸，但由其評估的脂肪酶的應(yīng)用并不局限于此反應(yīng)。

2.4 水解反應(yīng)和合成反應(yīng)中位置專一性的對比分析

在薄層色譜法測定水解反應(yīng)中酶的位置專一性中，三油酸甘油酯最常用。但高純度的三油酸甘油酯價格太高，特別是對于大規(guī)模的篩選任務(wù)。如表1所示，山茶油中大約80%為油酸，因而粗三油酸甘油酯可以利用山茶油為原材料通過硅膠柱層析分離得到。雖為粗品，但由于其不含有甘油二酯、甘油單酯和游離脂肪酸，因此能夠被成功用于薄層色譜分析。從圖5可以得出，Lipozyme RM IM、Novozym 435、L02、L03和L04在水體系中為sn-1（3）位專一性，L01能夠催化所有3個位置的酯鍵。這些結(jié)果與文獻中的報道一致［17-22］。

從2種方法所得結(jié)果的對比可知，Lipozyme RM IM、L01、L02、L03和L04在水解反應(yīng)和合成反應(yīng)中的位置專一性是相同的。Sugihara等［17］報道的一種青霉菌（Penicillium abeanum）產(chǎn)的脂肪酶水解sn-1 （3）位酯鍵的速率是sn-2位的大約9倍，其傾向性與L01在合成反應(yīng)中的專一性比值（表2）相當接近。顯然，差異僅存在于 Novozym 435。Watanabe等［23］認為Novozym 435的位置專一性與反應(yīng)體系的極性相關(guān)，極性越高，專一性越強。Duan等［24］也研究了溶劑對它的位置專一性的影響，隨著溶劑的log P值增長，它的專一性會變?nèi)酢？傊琋ovozym 435的位置專一性會受到反應(yīng)體系的影響，這意味著水解判定法不能總是準確預(yù)測脂肪酶在合成反應(yīng)中的表現(xiàn)。而月桂酸和山茶油在無溶劑體系中的酸解反應(yīng)則能避免這個問題。此外，對于熱敏性脂肪酶催化的反應(yīng)，可以向體系中添加低極性和高log P值的溶劑，如正己烷等，此類溶劑在降低反應(yīng)溫度的同時對脂肪酶的影響最小。

雖然基于薄層色譜分析的水解法的操作更簡單，但酸解法仍然具有一些優(yōu)勢：定量地反映位置專一性和直接體現(xiàn)脂肪酶在無水體系中的特性。但對于酶活過低的脂肪酶，2種方法都不能準確判定其位置專一性。

圖5 水解反應(yīng)中脂肪酶的位置專一性

3 結(jié)論

本研究建立了在無溶劑體系中分析脂肪酶的位置專一性的方法。模型反應(yīng)是以月桂酸和山茶油為底物的酸解反應(yīng)。考慮到酰基遷移、底物熔點、反應(yīng)物充足性、轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)效率等，推薦的反應(yīng)條件為50℃和2～4 h。基于酸解法和水解法判定結(jié)果的對比分析，脂肪酶在無水體系和水體系中的位置專一性大多是一致的，除了一些對溶劑體系敏感的酶類，例如Novozym 435。篩選脂肪酶是許多研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)工作。對于合成反應(yīng)判定體系，為了便于分析產(chǎn)物的甘油三酯種類和含量，反應(yīng)底物通常要求是3個位置為相同脂肪酸或者至少1和3位脂肪酸必須相同的高純度甘油三酯。而本方法降低了該判定體系中對底物純度的要求，反應(yīng)成本顯著降低，因此，從大量的酶中篩選出適合于特定酯類合成和油脂改性的脂肪酶就變得可行。

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Analysis of Regioselectivity of Lipases Using Acidolysis of Lauric Acid and Camellia Oil

Cao Xi1Wei Wei1Zhang Xi2Feng Fengqin1
（Zhejiang Key Laboratory for Agriculture Products Processing Technology Research；Department of Food Science and Nutrition，Zhejiang University1，Hangzhou 310058）
（Yunnan College of Traditional Chinese Medicine2，Kunming 650500）

Regioselectivity of lipases played a crucial role in structured lipids synthesis and oil modification. Because of differences between aqueous and non-aqueous systems，regioselectivity analyzed by the conventional hydrolysis method might not always match that in synthesis reactions.In this paper，acidolysis of lauric acid and camellia oil was developed to directly evaluate regioselectivity of lipases in solvent-free system.Fatty acid composition and positional distribution of reaction products were detected by gas chromatography.Through this protocol，Lipozyme RM IM，L02，L03 and L04 were identified as sn-1（3）regioselectivity，L01 was partially selective，and Novozym 435 was nearly non-selective.Predictability of the model reaction had been verified by replacing substrates of lipases. According to the comparative analysis of results of the acidolysis method and hydrolysis one，regioselectivity of lipases under two situations was generally the same，except selectivity of Novozym 435 which was susceptible to solvent systems.Therefore the present method avoided limits of hydrolysis determination results in synthesis reactions.And moreover it lowered the requirement on purity of reactants，which means it can be used to screen numerous lipases at low cost.

lipase，regioselectivity，camellia oil，acidolysis，synthesis

TQ925+.6

A

1003-0174（2017）03-0074-07

浙江省重大科技專項（2012C12005-2）

2015-08-13

曹茜，女，1988年出生，博士，食品科學(xué)

馮鳳琴，女，1964年出生，教授，博士生導(dǎo)師，食品化學(xué)與食品生物技術(shù)