油茶籽油甘三酯組成的NARP-HPLC-EISD分析及其在高溫處理過程中的降解研究

王進英 鐘海雁 馮 納 周 波（中南林業科技大學食品科學與工程學院；稻谷及副產物深加工國家工程實驗室；經濟林育種與栽培國家林業局重點實驗室，長沙 410004）

油茶籽油甘三酯組成的NARP-HPLC-EISD分析及其在高溫處理過程中的降解研究

王進英 鐘海雁 馮 納 周 波
（中南林業科技大學食品科學與工程學院；稻谷及副產物深加工國家工程實驗室；經濟林育種與栽培國家林業局重點實驗室，長沙 410004）

油茶籽油甘三酯在優化條件下得到良好分離，在14種甘三酯中含量水平前三的分別為OOO +SLO（74.21%）、OOP（10.64%）和OOL+SLL（5.19%）。方差分析表明來自不同產地的油茶籽油甘三酯分布情況存在差異。油茶籽油在深層煎炸過程（180℃）中甘三酯的總體損失率為47.85%，ECN40、ECN42、ECN44、ECN46、ECN48和ECN50區的甘三酯損失率分別為86.73%、91.52%、75.97%、45.01%和55.30%。LLL和PPL歷經40 h煎炸后完全降解。與深層煎炸油樣相比，加熱（180℃）樣品中甘三酯的降解程度相對降低。偏相關分析表明油茶籽油甘三酯在深層煎炸過程中的降解速率與極性組分的生成速率呈負相關。

油茶籽油 甘三酯 無水反相高效液相色譜-蒸發光散射檢測器 高溫處理

甘三酯是通過酯鍵將脂肪酸連接到甘油骨架上組成的，它是油脂的主要成分（95%～98%）。甘三酯的總碳原子數，脂肪酸不飽和程度，雙鍵位置及脂肪酸在甘油骨架上的立體異構等特性決定了油脂的理化及生物學特性。油脂中的甘三酯組成分析是一項艱巨的任務。應用不同的分離技術如薄層色譜［1］、固相萃取［2］和制備型高效液相色譜［3］對甘三酯進行純化。純化或未純化的的甘三酯隨后通過不同的色譜方法如高效液相色譜［4］、高溫氣相色譜［5］和薄層色譜［1］等進行分離，其中高效液相色譜是最常用的方法。甘三酯高效液相色譜分析中可用的檢測器有紫外［6-7］、示差［8-9］、蒸發光散射［10］和質譜［11］等。其中，蒸發光散射檢測器不僅對流動相沒有吸收還可以進行梯度洗脫，而且其靈敏度僅次于質譜。在分析甘三酯眾多的方法中，無水反相高效液相色譜-蒸發光散射檢測器（NARP-HPLC-ELSD）法是最常用的。

油脂甘三酯分析在油脂分析中應用廣泛，如將甘三酯分析與統計學結合可解決油脂品種［12］，產地［13］，不同處理的品質［14］等的識別及摻偽［15］研究。此外，甘三酯在高溫處理過程中歷經氧化，水解，異構化及聚合等作用后會產生揮發性組分，水解產物，氧化三酰甘油單體，環化物，反式結構化合物，聚合物等物質。了解高溫處理條件下甘三酯降解的反應機制及其產物，有助于闡明甘三酯的熱氧化穩定性，從而控制油脂高溫處理操作。本試驗在優化油茶籽油中甘三酯分析條件的基礎上，對不同產地油茶籽油的甘三酯分布及其在深層煎炸中的降解進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究所用的油茶籽油樣品如表1所示。

表1 油茶籽油樣品信息表

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

Shimadzu LC-20AD高效液相色譜儀（配備有CMB-20A控制器、LC-20AD二元泵、SIL-20A自動進樣器和CTO-10AS柱溫箱）：日本Shimadzu公司；2000ES-蒸發光散射檢測器：美國奧泰科技（中國）有限公司；ZORBAX SB-C18分析型色譜柱（4.6 mm×250 mm；5 μm），美國Agilent公司；XW-80A渦旋混合器：上海金科實業有限公司：HY-81煎炸鍋（50～200℃）：廣州港洋機電設備有限公司；AL204型電子天平：Mettler Toledo儀器（上海）有限公司；DW-86L628型超低溫冰箱：海爾公司。

1.2.2 標準品與試劑

三亞油酸甘油酯（LLL）、三肉蔻酸甘油酯（MMM）、1，2-亞油酸-3-油酸甘油酯（LLO）、1，2-油酸-3-亞油酸甘油酯（OOL）、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯（POL）、三油酸甘油酯（OOO）、1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油酯（OOP）、1，3-硬脂酸-2-亞油酸甘油酯（SLS）及1，3-硬脂酸-2-油酸甘油酯（SOS）（純度為99%）：上海甄準生物科技有限公司；乙腈，丙酮，異丙醇：色譜純，美國TEDIA天地試劑公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 高溫處理過程

將新鮮土豆去皮切條（40～50 mm ×10 mm × 10 mm），浸泡于冷水中。在煎炸鍋中倒入5 L的油茶籽油樣品G，打開電源開關預熱（30 min）至（185± 5）℃后將準備好的土豆條（125 g）浸沒于油樣中進行煎炸。煎炸1 h為1組，每組煎炸4批次，每批次煎炸4 min，隔11 min后進行下一批次煎炸。完成每組煎炸后，在室溫條件下冷卻煎炸油至60℃再進行下一組的煎炸處理。每2 h取50 g油樣與棕色瓶中在-20℃條件下貯藏待分析。每天煎炸6 h，煎炸周期為7 d。煎炸過程中不添加新鮮油樣。在相同的條件下用同樣的步驟制備加熱樣品，只是在加熱過程中沒有煎炸土豆的批處理。

1.3.2 極性組分測定

極性組分測定步驟結合國際純粹與應用化學協會的標準方法IUPAC 2.507［16］和我國的GB／T 5009. 202—2003［17］標準進行。

1.3.3 樣品制備

準確稱量油茶籽油樣品（0.05±0.01）g溶于異丙醇定容至10 mL，用均質機混勻約1 min。用一次性注射器取1 mL經0.45 μm濾膜過濾后進樣20 μL在優化液相色譜條件下進行分析。

1.3.4 甘三酯液相色譜分析條件

油茶籽油甘三酯分析條件為：流動相組成為乙腈和異丙醇，流速及洗脫梯度見表2；柱溫25℃；蒸發光散射檢測器參數為：漂移管溫度80℃、空氣流速2.8 L／min、增益為1。

表2 油茶籽油甘三酯分析梯度洗脫參數

1.4 數據分析

利用Microsoft Excel 2007和SPSS 17.0對試驗數據進行方差分析和偏相關分析。

2 結果與討論

2.1 甘三酯分析條件的優化

2.1.1 流動相組成，流速及洗脫梯度

分別用乙腈-丙酮和乙腈-異丙醇對油茶籽油中的甘三酯進行等度（25∶75）洗脫，發現前者的洗脫時間是后者的3倍。此外，考慮到異丙醇的強洗脫能力，對甘三酯的良好選擇性及低毒性，選擇乙腈-異丙醇為流動相。在1 mL／min的流速下以不同配比的乙腈-異丙醇對油茶籽油進行洗脫，隨著流動相中異丙醇比列的降低油茶籽油中甘三酯的分離度提高，但分析時間延長至。因此，將流速提高至1.2 mL／min。結合流動相配比和流速對油茶籽油甘三酯分離效果的影響進行梯度洗脫。最終優化梯度為：0～1 min，40%；1～15 min，40%～30%B；15～60 min，30% B；60～75 min，30%～40% B；75～85 min，40%B。

2.1.2 柱溫

在不同柱溫（25、30、35、40、45℃）條件下分析樣品C。柱溫為25℃時，油茶籽油中的甘三酯分離度良好。雖然較高的柱溫會縮短分析時間，但對甘三酯的選擇性也會隨之降低。

2.1.3 檢測器參數

以油茶籽油C為樣品，在不同的漂移管溫度（70、75、80、85、90、95℃）和空氣流速（2.8、2.6、2.4、2.2、2.0、1.8 L／min）進樣分析，選擇可獲得良好分離度和噪聲較小基線的參數為最終選擇。結果表明，漂移管溫度和空氣流速的最佳參數分別為80℃和2.8 L／min。檢測器的增益設定為1，因為噪聲水平會隨增益的增大而升高并且油茶籽油的甘三酯的相應信號可達到定性定量分析的要求。

2.2 油茶籽油中甘三酯的定性與定量分析

由甘三酯標品的相對保留時間完成油茶籽油甘三酯組成的初步定性分析。圖1為TAG標品（a）和油茶籽油C（b）甘三酯組成色譜圖，經對比可發現油茶籽油中含LLL、LLO、OOL、POL、OOO、OOP、SLS及7種未知的甘三酯（峰10、11、12、13、14、15和16）。在油脂甘三酯分析中，還可根據甘三酯分布情況已知的油脂來確認甘三酯組成未知的樣品。根據大豆油中甘三酯的分布情況，可確定峰10、11、12和13分別為LLLn、OLLn、PLL和PPL［6-9］，這與Alam Zeb［18］和張東［19］等的研究相符。雖然目前PPL在茶油中的分布沒有相關報道，但在橄欖油、葡萄籽油、榛子油、花生油大豆油和玉米油中PPL均存在［14］。同樣的，根據其他植物油甘三酯的分布情況可確定峰14、15和16分別為POP［20-21］，SOO［21］和 POS［12］。

圖1 TAG標品（a）和油茶籽油C（b）甘三酯組成色譜圖

等價碳原子數（ECN）是甘三酯分析中很重要的一個參數，ECN=CN（碳原子數）-2DN（雙鍵數目）。從圖1可以看出，在優化分析條件下甘三酯按照ECN由小到大的順序分離，可根據ECN將油茶籽油中的甘三酯分為6個區。值得注意的是，ECN相同的甘三酯可能存在共洗脫峰，如在峰4中除了OOL還存在SLL［4］，這與張東等的研究結果一致［19］。在峰6中可能含有SLO，雖然在茶油中沒有相關報道，但在橄欖油中這2種物質為共洗脫物［21］。此外，在共洗脫峰中還可能存在同一物質的位置異構體如LLO／OLL／LOL。而這些相同ECN的甘三酯可通過 Logα來鑒別，Logα是相應的甘三酯的相對保留時間與三油酸甘油酯的相對保留時間比值的對數。以Logα為縱坐標，以甘三酯中雙鍵數目為橫坐標作圖（圖2），從圖2可根據甘三酯中的雙鍵數目推斷出甘三酯相應的相對保留時間，從而達到定性的目的。

圖2 Logα與甘三酯雙鍵數目

利用內部歸一化法進行定量，將洗脫出的所有甘三酯峰面積總和設定為100%。每種甘三酯的相對百分比由式（1）計算得到。

2.3 方法精密度驗證

按照1.3.3步驟制備樣品C，在優化色譜條件下連續測定6次，測得甘三酯各組分的保留時間和峰面積的RSD，以考察方法的精密度。如表3所示，8種物質的保留時間和峰面積的RSD分別小于2.58% 和3.58%，可達到分析要求。

表3 油茶籽油中甘三酯保留時間和峰面積精密度試驗結果（n=6）

2.4 不同產地油茶籽油甘三酯組分分析

由表4可以看出，油茶籽油甘三酯總體分布不同區中 ECN48區的百分比最高，其次為 ECN46，ECN44、ECN50和ECN42的含量水平相近，ECN40甘三酯在總體分布中的水平最低。在組成油茶籽油的14種甘三酯中含量水平在前三的分別為以OOO+SLO、OOP和OOL+SLL。

表4 不同產地油茶籽油中甘三酯分布情況／%

在7個油茶籽油樣品中，樣品 E中 ECN46、ECN50、ECN42和ECN40區的甘三酯含量明顯高于其他6個油樣。樣品A、C和E中ECN46甘三酯含量均超過平均水平，樣品B中含量最低。樣品C、E和A中ECN44和ECN42甘三酯的含量較高，尤其是樣品E，其含量分別為均值的4和5倍。ECN40甘三酯在各油樣中的含量以樣品E含量最高，其次為樣品C，而在樣品G中沒有檢測到ECN40甘三酯的存在。由表3的多重比較結果可看出，甘三酯的總體分布中，ECN48和ECN50區的甘三酯在不同地區的油茶籽油中差異不顯著，其他4個區差異性顯著且ECN40、ECN42和ECN44區的甘三酯分布差異顯著性高于ECN46區。

方差分析結果（表4）表明不同產地的油茶籽油中處在同一區的甘三酯分布也存在差異。在ECN42區，主要成分是 LLL，其中以樣品 E中含量最高。OLLn在各油樣中的含量很低，在樣品G中沒檢測到OLLn的存在。LLO是ECN44區主要的甘三酯，其含量約為PLL的2倍。OOL和SLL是ECN46區的主要甘三酯，而PPL的含量較低。ECN48區是油茶籽油中甘三酯含量最高的，這歸因于油茶籽油甘三酯組成中含量在前兩位的OOO+SLO和OOP，這與張東等［19］的研究結果一致。在樣品C和E中OOO+SLO的含量水平相對較低，但這2個油樣中OOP卻是最高的。ECN50區主要由SLS組成（2%），SOO和POS的含量水平相近。

2.5 油茶籽油甘三酯在煎炸過程中的降解

油茶籽油甘三酯在深層煎炸過程中的損失率為47.85%。極性組分（變性甘三酯）的測定結果表明，油茶籽油在深層煎炸過程中其生成率為38.11%。偏相關分析表明，在油茶籽油的深度煎炸過程中甘三酯的降解速率與極性組分的生成速率呈負相關（-0.36＞-0.992，P＜0．05），圖3為油茶籽油在高溫處理過程中甘三酯和極性組分的變化趨勢圖。

圖3 油茶籽油在深層煎炸過程中甘三酯和極性組分的變化趨勢

如表5和表6所示，樣品G中的LLL和PPL分別在煎炸32 h和14 h后未檢測到，而在加熱油中，經歷40 h加熱后完全損失的只有PPL。LLO的損失率在煎炸和加熱樣品中都位于第二，但其在深層煎炸條件下的降解速率是加熱條件的1.42倍。在加熱樣品中，OOL+SLL的降降解速率比LLL快，而在煎炸樣品中卻是相反的。OOO的損失速率低于同一區的POL。處在ECN50的3種甘三酯煎炸條件下的降解速率分別是加熱條件的1.92、1.94和1.62倍。此外，在油茶籽油中含量較低的POP在深層煎炸過程中較穩定，損失率為44.3%，在加熱油中損失率僅為23.36%。

表5 油茶籽油甘三酯在煎炸過程中的變化／%（n=3，RSD=2.35%）

表6 油茶籽油甘三酯在加熱過程中的變化／%（n=3，RSD=2.80% ）

甘三酯歷經高溫處理后會發生氧化、聚合及水解反應，從而產生揮發性組分，游離脂肪酸，氧化三酰甘油單體，環化物，反式結構化合物及聚合物等產物。根據Alarm［18］的研究，圖4中a區中是一些單酯及二酯類化合物，b區為一些環氧基或單個的氧化甘三酯。值得注意的是峰C是油茶籽油在深層煎炸過程中形成的一類累計速率很快的產物，具體結構有待于進一步分析。

圖4 油茶籽油深層煎炸前后對比圖

3 結論

油茶籽油甘三酯在優化條件下得到良好分離，在組成油茶籽油的6個區的14種甘三酯中含量水平在前三的分別為以 OOO+SLO（74.21%）、OOP （10.64%）和OOL+SLL（5.19%）。此外，還有5種含量水平在1%以上的甘三酯和6種含量水平在1%以下的甘三酯。方差分析結果表明來自不同產地的油茶籽油甘三酯分布情況存在差異。

樣品G在深層煎炸過程中甘三酯的總體損失率為47.85%，5個區甘三酯的損失率依次為86.73%、91.52%、75.97%、45.01%和55.30%。樣品G中的LLL和PPL歷經40 h煎炸后完全降解。LLO在深層煎炸過程中降解速率達高到86.73%，POP較穩定，損失率為44.3%。與深層煎炸樣品相比，加熱樣品中甘三酯的降解程度相對較低。油茶籽油甘三酯在深層煎炸過程中的降解速率與極性組分的生成速率呈負相關。

［1］Fuchs B，Sü? R，Teuber K，et al.Lipid analysis by thinlayer chromatography-A review of the current state［J］. Journal of Chromatography A，2011，1218（19）：2754-2774

［2］COI／T.20／DOC.NO25.Improved HPLC analysis of triglycerides by oven terperature gradient［S］

［3］Wojtusik M J，Brown P R，Turcotte J G.Semi-preparative HPLC fractionation of consumer fish oil（Triacylglycerols）［J］.Journal of liquid chromatography，1998，11：2091-2107

［4］COI／T.20／DOC.NO20／Rev.2.Difference between actual and theoretical content of triacylglycerols with ECN 42［S］

［5］Samblasa C R，Gonzalez A C，Rodriguez L C，et al.Application of selected ion monitoring to the analysis of triacylglycerols in olive oil by high temperature gas chromatographymass spectrometry［J］.Talanta，2010，82（1）：255-260

［6］IUPAC Method 2.324.Standard methods for the analysis of oils，fats and derivatives［S］

［7］AOCS Official Method Ce 5b-89：Sampling and analysis of commercial fats and oils-triglycerides in vegetable oils by HPLC［S］

［8］IUPAC Method 2.325.Standard methods for the analysis of oils，fats and derivatives［S］

［9］AOCS Official Method Ce 5c-93：Sampling and analysis of commercial fats and oils-individual triacylgrycerides in oils and fats by HPLC［S］

［10］皇甫志鵬，薛雅琳，劉元法，等.甘三酯指紋圖譜相似度在芝麻油摻混檢測中的應用［J］.中國糧油學報，2013，28（2）：117-22 Huangfu Zhipeng，Xue Yalin，Liu Yuanfa，et al.Application of similarity of triacylglycerol fingerprint to discriminate blended sesame oil［J］.Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2013，28（2）：117-22

［11］Kalpio M，Nylund M，Linderborg K M，et al.Enantioselective chromatography in analysis of triacylglycerols common in edible fats and oils［J］.Food Chemistry，2015，172：718-724

［12］Lerma-Garcia M J，Barberan M V，Herrero-Martinez J M，et al.Acrylate ester-based monolithic columns for capillary electrochromatography separation of triacylglycerols in vegetable oils［J］.Journal of Chromatography A，2011，1218：7528-7533

［13］Samblás C R，Rodríguez L C，Casado A G，et al.Multivariate analysis of HT／GC-（IT）MS chromatographic profiles of triacylglycerol for classification of olive oil varieties［J］. Anal Bioanal Chem，2011，399：2093-2103

［14］Bosque-Sendraa J M，Cuadros-Rodrigueza L，Ruiz-Samblasa C，et al.Combining chromatography and chemometrics for the characterization and authentication of fats and oils from triacylglycerol compositional data-A review［J］. Analytica Chimica Acta，2012，724：1-11

［15］Salghi R，Armbruster W，Schwack W.Detection of argan oil adulteration with vegetable oils by high-performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection ［J］.Food Chemistry，2014，153：387-392

［16］IUPAC standard method 2.508.Determination of polar compounds in frying fats［S］

［17］GB／T 5009.202—2003食用植物油煎炸過程中的極性組分（PC）的測定［S］GB／T 5009.202—2003 Determination of polar compouds in edible vegetable oils used in frying food［S］

［18］Alam Zeb.Triacylglycerols composition，oxidation and oxidation compounds in camellia oil using liquid chromatogra-phy-mass spectrometry［J］.Chemistry and Physics of Lipids，2012，165：608-614

［19］張東，龍伶俐，薛雅琳，等.液質聯用分析常見植物油甘

油三酯［J］.糧油食品科技，2012，20（6）：33-37 Zhang Dong，Long Lingli，Xue Yalin，et al.Analysis of triglycerides in vegetable oil by HPLC-Q／TOF［J］.Science and Technology of Cereals，Oils and Foods，2012，20（6）：33-37

［20］L′?sa a M，Lynen F，Holˇcapek M，et al.Quantitation of triacylglycerols from plant oils using charged aerosol detection with gradient compensation［J］.Journal of Chromatography A，2007，1176：135-142

［21］COI／T.20／DOC.NO 25／Rev.1.Global method for the detection of extraneous in olive oil［S］.

Analysis of NARP-HPLC-EISD Composed by Camellia Oleosa Seed Oil Triacylglycerol and Degradation Research During High-Temperature Processing

Wang Jinying Zhong Haiyan Feng Na Zhou Bo
（College of Food Science and Engineering，Central South University of Forestry and Technology；National Engineering Laboratory of Rice and by-products Deep Processing，Changsha；Key laboratory of Economic Forest Breeding and Cultivation of State Forestry Administration of the People′s Republic of China，Changsha 410004）

The camellia oleosa seed oil triacylglycerol was separated completely under optimistic condition，in which OOO+SLO（74.21%），OOP（10.64%）and OOL+SLL（5.19%）were top three compounds among 14 triacylglycerol triacylglycerols.The analysis of variance showed that the difference happened to camellia oleosa seed oil triacylglycerols from different production areas.The overall loss ratio of camellia oleosa seed oil during deep frying （180℃）were 47.85%，and the loss ratio of triacylglycerols in each partition（ECN40，ECN42，ECN44，ECN46，ECN48and ECN50）were 86.73%，91.52%，75.97%，45.01%and 55.30%，respectively.LLL and PPL were totally decomposed after frying treatment for 40 h.Compared with deep frying samples，the degradation level of heating （180℃）oil was relatively lower.Partial correlation analysis showed that a negative correlation between the degradation ratio of camellia oleosa seed oil triacylglycerol during deep frying and generation ration of polar compounds existed.

camellia oleosa seed oil，triacylglycerol，NARP-HPLC-EISD，high temperature processing

TS221

A

1003-0174（2017）03-0054-07

國家自然科學基金（31070612），湖南省研究生科技創新基金（CX2015B283）

2015-08-12

王進英，女，1989年出生，博士，木本糧油品質保持及高效利用

鐘海雁，男，1963年出生，教授，木本糧油品質保持及高效利用