脂肪酶催化稻米油酯交換制備低熱量結構脂及其動力學研究

趙 妍肖志剛，任海斌楊宏黎楊慶余白俊堃許 巖劉春景（東北農業大學食品學院，哈爾濱 50030）（沈陽師范大學糧食學院，沈陽 0034）

脂肪酶催化稻米油酯交換制備低熱量結構脂及其動力學研究

趙 妍1肖志剛1，2任海斌1楊宏黎2楊慶余1白俊堃1許 巖1劉春景1
（東北農業大學食品學院1，哈爾濱 150030）
（沈陽師范大學糧食學院2，沈陽 110034）

以三丁酸甘油酯和稻米油為原料采用固定化脂肪酶Lipozyme RM IM酯交換合成低熱量結構脂，研究了底物質量比、酶添加量、反應溫度、反應時間對結構脂轉化率的影響，并以乒乓機制為動力學模型，建立脂肪酶催化制備結構脂的動力學方程。通過單因素試驗確定最佳結構脂制備條件為底物質量比4∶1，酶添加量10%，反應溫度50℃，反應時間24 h。三丁酸甘油酯與稻米油在無溶劑體系中的進行酯交換反應的初速度的動力學反應模型為V，經驗證表明計算值與實驗值較吻合，反應符合乒乓機制。

稻米油 酯交換 結構脂 動力學模型

短長鏈結構脂具有熱量低，抑制體脂積累的特性，其合成方法主要有化學法和生物酶法，化學法反應條件劇烈且生成的產物隨機，不能得到期望的產物［1-2］。酶法合成具有選擇性高、副產物少、產物純度高的特點。

而酶法合成主要集中于酸解法，其插入率較低，酰基轉移率較高，而目前關于酯-酯交換的方法生產短長鏈結構脂研究較少［3-4］。近年來，酯-酯交換對油脂進行改性的工藝已在國外油脂生產中運用，例如低熱量結構脂salatrim等。與傳統酸解法相比，酯酯交換具有結構脂產率高且高氧化穩定性的特點［5］。

稻米油富含多不飽和脂肪酸，并且含有對人體有益的谷維素和維生素E、甾醇等成分［6-7］。三丁酸甘油酯具有修復小腸絨毛，抑制腸道有害菌的功效，并且對多種癌細胞如前列腺癌、乳腺癌等細胞增殖具有抑制作用［8-12］。以稻米油為甘油骨架，三丁酸甘油酯為酰基供體的結構脂生產方法鮮見報道。

本文采用稻米油和短鏈脂肪酸酯三丁酸甘油酯進行酶法酯交換，在固定化脂肪酶Lipozyme RM IM的催化條件下進行酶促酯交換，通過研究底物質量比、反應溫度、反應時間、酶添加量等參數，探討其對結構脂轉化率的影響，并以乒乓機制的動力學模型為基礎，研究了底物三丁酸甘油酯濃度對反應初速度的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

金龍魚稻米油：市售；三丁酸甘油酯：上海源葉生物科技有限公司；Lipozyme RM IM：丹麥諾維信公司；色譜級乙腈、色譜級異丙醇、色譜級正己烷：山東禹王實業有限公司化工分公司。

1.2 試驗儀器與設備

HZQ-C數顯空氣浴恒溫振蕩器：金壇市天竟實驗儀器廠；KQ400-DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲波儀器有限公司；Agilent 1100LC高效液相色譜儀：鄭州中譜儀器設備有限公司；DF110型電子分析天平：中國輕工機械總公司常熟衡器工業公司；Avan-ti J-26XP高速冷凍離心機：天津厚普生物技術開發有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶促酯交換

將一定質量比的三丁酸甘油酯和稻米油放于圓底燒瓶內，混合均勻后加入一定量的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，于預定溫度下的空氣浴恒溫振蕩反應器內反應一定時間，反應結束后經離心過濾除去酶，樣品密封保存于-20℃待檢測分析。

1.3.2 結構脂含量檢測

檢測方法參考 Lisa［13］。準確稱取一定量的樣品，用乙腈-異丙醇-正己烷溶液（2∶2∶1 V／V）溶解至濃度為10 mg／ml，色譜條件：儀器：Agilent 1100LC高效液相色譜儀；色譜柱為 Agilent zorbax C18 （5 μm，4.6 mm×250 mm），紫外檢測器（205 nm）。流動相為異丙醇 -乙腈（60∶40，V／V），流速：0.8 mL／min，柱溫35℃，進樣量，5 μL，分析時間25 min。

1.3.3 結構脂轉化率測定

采用面積歸一化法及理論碳數定性并計算LSL 及SLS型結構脂的含量。

酯交換程度=（反應后LSL及SLS型結構脂峰面積）／（樣品中甘三酯峰面積總和）×100%

1.3.4 反應初速度測定

反應進行到30 min時取樣檢測，以單位時間里三丁酸甘油酯的總減少量作為酯交換反應的反應初速度［14］。

反應初速度計算V初=

式中：n為酯交換反應消耗三丁酸甘油酯的物質的量／mol；V為反應體系的總體積／L；t為反應時間／min。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 底物質量比對結構脂轉化率的影響

選擇三丁酸甘油酯與稻米油質量比分別為：1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，酶添加量10%，反應溫度50℃，反應時間18 h考察底物質量比對結構脂轉化率的影響。如圖1所示。

從圖1可以看出當底物質量比由1∶1增至4∶1時，結構脂轉化率由36.32%升至55.48%，當底物質量比超過4∶1時，由于酶的缺乏，導致部分三丁酸甘油酯不能完全轉化［15］。同時，隨著三丁酸甘油酯的量的相對增長，副產物的含量也會增加。因此在保證結構脂的轉化率及節約資源的前提下，選擇底物質量比4∶1為最佳條件［16］。

圖1 底物質量比和酶添加量對結構脂轉化率的影響

2.1.2 酶添加量對結構脂轉化率的影響

選擇酶添加量為：4%、6%、8%、10%、12%5個水平，底物質量比3∶1，反應溫度50℃，反應時間18 h考察酶添加量對結構脂轉化率的影響。如圖1所示。

從圖1可以看出酶添加量的增加可以大大縮短酯交換反應到達平衡的時間，當酶添加量從4%增加到10%時，結構脂的轉化率呈現線性增長的趨勢，這與當前報道的結論相一致［17］。而當酶添加量超過10%時，結構脂的轉化率基本保持不變，原因是盡管體系中酶添加量增加，但是能夠發生酯交換反應的有效酶量卻達到了“酶飽和”現象，而且過量的酶會影響酯交換反應進程中底物之間的傳質效率，在其他的酯交換反應中也有研究發現類似的反應特點［18］。

2.1.3 反應溫度對結構脂轉化率的影響

選擇反應溫度為：40、45、50、55、60℃ 5個水平，底物質量比3∶1，酶添加量10%，反應時間18 h考察反應溫度對結構脂轉化率的影響。如圖2所示。

圖2 反應溫度和反應時間對結構脂轉化率的影響

從圖2可以看出，在40～50℃時，隨著反應溫度的升高，結構脂的轉化率呈上升趨勢，原因可能是溫度升高加速了分子間的重排速率，提高了酶的催化活性，但當反應溫度過高時會導致酶的失活［19-21］。因此，考慮到反應速率以及酶的活性，50℃是Lipozyme RM IM酶催化三丁酸甘油酯和稻米油酯交換合成結構脂的最適溫度。

2.1.4 反應時間對結構脂轉化率的影響

選擇反應時間為：6、12、18、24、30 h 5個水平，底物質量比3∶1、酶添加量：10%、反應溫度：50℃考察反應時間對結構脂轉化率的影響。如圖2所示。

從圖2中可以看出，在反應的前24 h內，反應速率呈現線性增長的趨勢；在反應時間24 h后，反應速率增長趨勢減緩，在 30 h后反應基本達到平衡［22-23］。從節約能源角度出發，24 h為反應最佳時間。

2.1.5 固定化脂肪酶的重復利用次數

研究固定化脂肪酶的重復利用次數可以很大程度上降低生產低熱量結構脂的成本，本文采用多批次反應對固定化脂肪酶催化三丁酸甘油酯與稻米油酯交換制備低熱量結構脂的催化活力穩定性進行研究，如圖3所示，結果表明，隨著反應批次的增長，由于酶活力的降低結構脂的轉化率呈緩慢下降趨勢，說明在無溶劑體系下固定化脂肪酶具有較好的操作穩定性，因此Lipozyme RM IM脂肪酶用于酯交換法合成低熱量結構脂可以節約資源，具有良好的應用前景［24］。

圖3 固定化脂肪酶Lipozyme RM IM的重復使用性

2.1.6 低熱量結構脂HPLC分析

低熱量結構脂經C18色譜柱分離后出峰順序遵循當量碳數（ECN=CN-2DB，CN為酰基碳原子數、DB為雙鍵數）的遞增順序。合成后結構脂各組分如圖4所示，從左到右依次為SSS型甘油酯（1），SLS型甘油酯（2），LSL型甘油酯（3）以及少量的LLL型甘油酯（4、5、6、7、8、9、10、11），其中結構脂質量分數為57.14%，有利于進一步對其分子蒸餾純化。

圖4 結構脂HPLC分析圖

2.2 動力學模型

固定化脂肪酶催化三丁酸甘油酯和稻米油的酯交換反應分為水解和酯化兩個連續的步驟，符合雙底物反應的乒乓機制［25］。在酯交換過程中可將稻米油中的甘油三酯視為一個整體與三丁酸甘油酯進行反應，為了方便酶促酯交換反應的動力學公式推導，將這個整體命名為B，三丁酸甘油酯命名為A。

蘇定正等認為有意義的酯交換反應中所涉及的水解和酯化反應并不可逆［26-27］。因此，在動力學模型中忽略可逆反應。由此，固定化脂肪酶促米糠油和三丁酸甘油酯進行酯交換反應的反應初速度（V）動力學方程可由式（1）表示：

轉化為倒數形式：

根據不同底物質量比得到不同Y值的基礎上，利用最小二乘法計算出的理論值，由此可得KmA、KmB、Kmax，將其回代入方程（1）即可得到固定化脂肪酶促酯交換反應制備結構脂時，三丁酸甘油酯與稻米油生成低熱量結構脂的反應初速度動力學方程［28］。

2.3 底物濃度對反應初速度的影響

將三丁酸甘油酯和稻米油分別按照質量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1進行酶促酯交換反應，30 min后測其反應初速度。根據動力學模型計算得出KmA= 0.169 2 mmol／g，KmB=0.148 6 mmol／g，Kmax=5.413× 10-3mmol／（g·min）。將其值代入方程，得到無溶劑體系中酶法酯交換合成低熱量油脂的反應初速度的動力學方程為：

根據方程繪制曲線圖。如圖5所示，計算值和實驗值相近，說明上述方程可以描述固定化脂肪酶催化三丁酸甘油酯與稻米油進行酯交換的反應初速度，高濃度的三丁酸甘油酯對反應初速度存在抑制作用，反應符合乒乓反應機制。

圖5 三丁酸甘油酯濃度與反應初速度的關系

3 結論

對無溶劑體系中固定化脂肪酶催化三丁酸甘油酯和稻米油酯交換反應合成低熱量結構脂進行了研究。研究表明在三丁酸甘油酯與稻米油底物質量比4∶1，酶添加量10%，反應溫度50℃，反應時間24 h時為最佳工藝條件，結構脂轉化率達57%，由雙底物抑制的乒乓機制模型可以很好的描述脂肪酶催化稻米油和三丁酸甘油酯酯交換反應，且高濃度的三丁酸甘油酯對反應速率存在抑制作用。

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Research on Lipase Catalysis Rice Bran Oil for Exchange and Preparation of Low Calorie Structure Lipid and Dynamics

Zhao Yan1Xiao Zhigang1，2Ren Haibin1Yang Hongli2Yang Qingyu1Bai Junkun1Xu Yan1Liu Chunjing1
（College of Food Science，Northeast Agricultural University1，Haerbin 150030）
（College of Grain，Shenyang Normal University2，Shenyang 110034）

Taking the tributyrin and rice bran oil as raw materials，immobilized lipase and RM IM ester were used to exchange and compound low calories structure lipid，Effect of mass ratio of substrates，enzyme concentration，reac-tion temperature and reaction time on conversion rate of structure lipid，was researched.The kinetic equation of preparation of structure lipid was established based on taking Ping Pong mechanism as kinetic model.The optimal preparation conditions for structure lipid based on signal-factor experiment were mass ratio of substrates of 4∶1，enzyme dosage of 10%，reaction temperature of 50℃，reaction time of 24 h.The kinetic response model of initial velocity of interesterification between tributyrin and rice bran oil in the system without solvent was V=.The investigation indicated that calculated value was consistent with actual value and reaction accorded with Ping Pong mechanism.

rice bran oil，interesterification，structural lipid，kinetic model

TS2

A

1003-0174（2017）03-0042-06

“十二五”國家科技支撐計劃（2012BAD34B02），黑龍江省教育廳科學技術研究重點項目（12511z006），哈爾濱市優秀學科帶頭人基金（2012 RFXXN107），遼寧省級公關項目（2014205007），沈陽市農業科技攻關（F14-104-3-00）

2015-07-28

趙妍，女，1991年出生，碩士，糧食油脂及植物蛋白工程

肖志剛，男，1972年出生，教授，糧食油脂及植物蛋白工程