紫砂蕓豆花色苷的超聲／微波協同提取研究及其組成分析

李良玉宋大巍刁靜靜賈鵬禹張麗萍，（黑龍江八一農墾大學國家雜糧工程技術研究中心，大慶 69）（東北林業大學林學院，哈爾濱50040）（黑龍江八一農墾大學食品學院，大慶 69）

紫砂蕓豆花色苷的超聲／微波協同提取研究及其組成分析

李良玉1，2宋大巍3刁靜靜1賈鵬禹1張麗萍1，3
（黑龍江八一農墾大學國家雜糧工程技術研究中心1，大慶 163319）
（東北林業大學林學院，哈爾濱2150040）
（黑龍江八一農墾大學食品學院3，大慶 163319）

以東北紫砂蕓豆為原料，采用單因素試驗和響應面優化試驗研究超聲／微波協同提取紫砂蕓豆中花色苷的工藝參數，并采用液質連用色譜法對提取物進行不同濃度乙醇洗脫，進行組分分析。結果表明，超聲／微波協同提取紫砂蕓豆花色苷的有效工藝參數為：微波功率251 W，液料比13.7 mL／g，提取時間24.9 min。不同濃度乙醇洗脫液的色譜分析發現，提取物中主要有5種花色苷物質，其中天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷含量較高，且主要集中在40%乙醇洗脫液中。本研究為大孔樹脂純化紫砂蕓豆花色苷提供了參考，為紫砂蕓豆花色苷的提取加工及工業應用提供依據。

紫砂蕓豆 花色苷 超聲／微波協同提取 組成分析

蕓豆，又名菜豆，豆科菜豆屬 （Phaseolus uvlgarisL.），原產中北美洲的墨西哥，我國16世紀末開始引種栽培，并開始進行種質的改良和雜交形成我國特有的品種［1-2］。目前黑龍江省是我國出產蕓豆品種數量最多的省份，主要品種有奶花蕓豆、紫花蕓豆、小白蕓豆、深紅蕓豆、中白蕓豆、黑蕓豆和紫砂蕓豆等［3］。蕓豆含有凝集素、尿素酶、功能性蛋白、皂甙、花色苷等功能成分，其具有提高人體自身的免疫能力，促進新陳代謝，降低血脂等功能特性［4］。目前，對蕓豆的研究主要集中在蕓豆淀粉、蕓豆凝集素、異黃酮、低聚糖、蕓豆蛋白等制取與功能特性研究［5-8］，在蕓豆花色苷的制取及其組分分析等研究還鮮有報道。因此，研究紫砂蕓豆花色苷的高效提取工藝以及花色苷提取物的組成對蕓豆的深度開發利用具有重要意義。

超聲／微波協同提取技術研究已有先例，王傳虎等［9］進行了微波-超聲協同提取廢棄綠豆種皮中綠色素的研究、盛瑋等［10］進行了超聲一微波協同提取超級黑糯玉米芯色素的工藝研究、馬合木提·買買提明等［11］進行了超聲-波協同萃取蕪菩籽中總黃酮提取工藝的研究均取得了良好的提取效果。目前，還沒有進行紫砂蕓豆花色苷提取方面的研究，本文針對紫砂蕓豆花色苷提取技術的研究，采用超聲／微波協同提取法、色譜分離純化技術，對實現工業化高效提取，開發紫砂蕓豆的高效能夠提供一定的理論基礎和技術參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

紫砂蕓豆：黑龍江省黑河市。

1.2 儀器與設備

Pharo300紫外可見光分光光度計：默克密理博；TGL16M高速臺式離心機：YINGTAI INSTRUMENT；CW-2000型超聲／微波協同提取儀：上海新拓微波溶樣測試技術有限公司；RPL-ZD10裝柱機：Column packing device；制備色譜系統500 mm×1.5 mm：國家雜糧工程技術研究中心；酸度計S220K：梅特勒·托利多；ME104電子天平：梅特勒·托利多；HPLC 1100 SERIES離子阱6310液質聯用儀：美國Agilent。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫砂蕓豆花色苷的提取

取一定量紫砂蕓豆，精選除雜，粉碎過篩，得到200微米粒度的粉末狀蕓豆粉。采用60%的乙醇（添加0.6%的鹽酸）溶液為提取劑，將蕓豆粉樣品浸泡在提取劑中，并置于超聲／微波協同提取儀中進行不同微波功率、不同提取時間、不同料液比、不同溫度下的提取，之后進行離心、過濾，最終得到紫砂蕓豆花色苷粗提液［12］。

1.3.2 紫砂蕓豆花色苷吸光度的測定

取提取后的紫砂蕓豆乙醇提取溶液，在紫外-可見分光光度計波長范圍為200～600 nm內進行掃描，測得其可見吸收光譜圖，選取可見吸收光譜中的明顯吸收峰進行紫砂蕓豆花色苷吸光值的測定，并作為測定最佳工藝條件標準。

1.3.3 超聲／微波協同提取紫砂蕓豆花色苷試驗

1.3.3.1 不同微波功率下提取紫砂蕓豆花色苷試驗

稱取制備的紫砂蕓豆粉10 g，按照1.3.1的提取技術路線進行提取操作。設定提取時間20 min，液料比20 mL／g，微波功率分別為100、200、300、400、500 W 5個水平，平行試驗5次（n=5）。提取完成后提取液稀釋10倍，測定其吸光度，進而計算出不同微波功率下紫砂蕓豆花色苷的提取率。

1.3.3.2 不同液料比時提取紫砂蕓豆花色苷試驗

稱取制備的紫砂蕓豆粉10 g，按照1.3.1的提取技術路線進行提取操作。設定提取時間20 min，微波功率為200 W，液料比分別為10、15、20、25、30、35、40 mL／g，平行試驗5次（n=5）。將液料比統一調配至20 mL／g后，提取液稀釋10倍，測定其吸光度，進而計算出不同料液比下紫砂蕓豆花色苷的提取率。

1.3.3.3 不同浸提時間提取紫砂蕓豆花色苷試驗

稱取制備的紫砂蕓豆粉10 g，按照1.3.1的提取技術路線進行提取操作。設定微波功率200 W，液料比20 mL／g，取時間分別為5、10、15、20、25 min，平行試驗5次（n=5）。提取完成后提取液稀釋10倍，測定其吸光度，進而計算出不同提取時間下的紫砂蕓豆花色苷的提取率。

1.3.3.4 響應面法優化工藝參數

在微波功率、液料比、提取時間等單因素試驗里選擇每個因素中最佳的數據作為響應面法優化試驗的參數，根據二次回歸組合試驗設計原理，以紫砂蕓豆花色苷吸光度為響應值，設計微波功率、液料比、提取時間3個因素的響應面法優化試驗，試驗設計見表1。

表1 因素水平編碼表

1.3.4 紫砂蕓豆花色苷的純化

利用響應面法優化的工藝參數進行紫砂蕓豆花色苷的提取，對此提取液利用制備色譜進行提純首先進行飽和吸附，進料流速為2.0 mL／min。飽和吸附后用去離子水進行沖洗，以去除雜質，沖洗流速2.0 mL／min，沖洗2～3倍柱體積，然后依次用40% 60%、80%乙醇洗脫劑進行梯度洗脫，分別收集洗脫劑進行測定，洗脫流速2.0 mL／min，洗脫劑（乙醇溶液）用量為2～3倍柱體積，收集洗脫液，洗脫液用旋轉蒸發器進行濃縮，濃縮液用于檢測花色苷的化學組成。

1.3.5 紫砂蕓豆花色苷的組成初步鑒定

本研究采用液-質聯用色譜的測定方法對紫砂蕓豆花色苷的組成進行初步鑒定。液-質聯用色譜條件如下：

液相色譜條件：色譜柱Kromasil-C18（250 mm× 4 mm，5 μm）；流動相A：2.0%甲酸溶液，流動相B 含2%甲酸的54%乙腈溶液；洗脫程序：0～1 min 10%B，1～17 min：10%～25%B；流速：1.0 mL／min進樣量30 μL，柱溫度30℃，檢測波長525 nm。

質譜條件：電噴霧電離源，正離子模式監測，電噴霧壓力35 psi，干燥氣流量為10 L／min，干燥氣溫度325℃，m／z設置范圍100～1 000［13］。

2 結果與分析

2.1 紫砂蕓豆花色苷光譜特性的測定結果

圖1是紫砂蕓豆花色苷提取物在紫外光譜條件下的光譜特性（吸光度）測定結果。由圖1可以看出紫砂蕓豆乙醇提取物紫外-可見光吸收光譜中含有2個明顯的吸收峰，符合黃酮類物質的吸收光譜特征。此外，紫砂蕓豆乙醇提取物的紫外-可見光吸收光譜曲線在520 nm處有最大吸收峰，符合花色苷類物質在可見光范圍內最大吸收峰在500～500 nm之間的特征。因此，可以初步鑒定本試驗提取的紫砂蕓豆乙醇提取物為花色苷類物質，選擇可見光范圍內最大吸收波長520 nm作為吸光度測定波長。

圖1 紫砂蕓豆花色苷的紫外-可見光吸收光譜曲線

2.2 超聲／微波協同提取紫砂蕓豆花色苷結果與分析

2.2.1 微波功率對紫砂蕓豆花色苷提取率的影響

試驗采用Statistical Analysis System（SAS）8.2統計軟件對試驗結果進行One-Way-ANOVA分析以及Duncan分析，在研究微波功率的五點三次重復的因素分析中P＜0.000 1，相關系數=0.924，說明微波功率對紫砂蕓豆花色苷的提取有顯著影響。由圖2可知隨著微波功率的增大，紫砂蕓豆花色苷的吸光度呈現上升趨勢。在100～300 W時，呈現上升的趨勢，超過300 W后有下降趨勢。因為，當微波功率在100～300 W時，微波功率不足傳質能力不足。微波功率超過300 W后會引起花色苷黃酮類物質結構的變化，導致吸光度下降影響花色苷的提取。因此，本研究選擇響應面優化微波功率范圍為在以300 W為中心200 W到400 W之間。

圖2 不同提取條件與紫砂蕓豆花色苷提取的關系

2.2.2 液料比對紫砂蕓豆花色苷提取的影響

試驗采用SAS 8.2統計軟件對試驗結果進行One -Way-ANOVA分析以及Duncan分析，在研究提取液料比的七點三次重復的因素分析中P＜0.000 1，相關系數=0.951，說明提取液料比對紫砂蕓豆花色苷的提取有顯著影響。由圖2可以看出，隨著提取液料比的不斷增大，紫砂蕓豆花色苷的吸光度值呈現上升的趨勢，這是由于少量溶劑很快溶解花色苷達到飽和，擴散推動力降低，當溶劑量足夠大時，對提取基本無阻礙，OD值逐漸提高；當液料比達到20 mL／g后，吸光度趨于平衡并有下降趨勢分析原因可能是隨著液料比的升高，其他成分的溶出也相對增多，從而抑制了紫砂蕓豆花色苷的溶出，從而影響紫砂蕓豆花色苷的提取。因此，本試驗選擇響應面優化提取液料比范圍為在以25 mL／g為中心，20 mL／g到30 mL／g之間。

2.2.3 提取時間對紫砂蕓豆花色苷提取的影響

試驗采用SAS 8.2統計軟件對試驗結果進行One-Way-ANOVA分析以及Duncan分析，在研究提取時間的五點三次重復的因素分析中P＜0.000 1，相關系數=0.967，說明提取時間對紫砂蕓豆花色苷的提取有顯著影響。由圖2可知隨著提取時間的延長，紫砂蕓豆花色苷吸光度呈現上升趨勢。在5～15 min時，提取率呈現快速上升的趨勢，在提取15 min左右達到最大，超過20 min有下降的趨勢，這可能是因為超聲時間過長，導致影響了花色苷的穩定性，會使紫砂蕓豆花色苷產生部分降解，破壞紫砂蕓豆花色苷結構，影響其生物活性。因此，本試驗選擇15 min為中心點10 min到20 min之間進行響應面試驗。

2.3 響應面優化試驗的結果與分析

2.3.1 響應面試驗結果與分析

基于單因素試驗結果確定的最佳條件，以微波功率／W，液料比／mL／g，提取時間／min，這3個因素為自變量（分別以X1、X2、X3表示），以紫砂蕓豆花色苷吸光度為響應值設計3因素共17個試驗點的三元二次回歸正交旋轉組合試驗，保證試驗點最少前提下提高優化效率，運用SAS 8.2軟件處理，試驗結果見表2。

采用SAS 8.2統計軟件對優化試驗進行響應面回歸分析（RSREG），回歸方程以及回歸方程各項的方差分析結果見表3，二次回歸參數模型數據如表4所示。

由表3可以看出：二次回歸模型的F值為10.41，模型R2為0.921 3，＜0.01，大于在0.01水平上的F值，而失擬項的F值為4.36，小于在0.05水平上的F值，說明該模型擬和結果好。一次項、二次項和交互項的F值均大于0.01水平上的F值，說明其對提取率有顯著的影響。

表2 試驗安排表以及試驗結果

表3 回歸方程各項的方差分析表

以紫砂蕓豆花色苷的吸光度為響應值，得出微波功率，液料比，提取時間的編碼值為自變量的三元二次回歸模型為：

Y=-4．710+0．003 5X1+0．278X2+0．136X3+ 0．000 003 3X12-0．000 073 5X1X2-0．000 095X1X3-0．004 13X2-0．003 17XX-0．001 81X2

2233

2.3.2 交互作用分析

采用降維分析法研究其他兩因素條件固定在零水平時，有交互作用的兩因素對紫砂蕓豆花色苷得率的影響。圖3是SAS8.2軟件繪出三維曲面及其等高線圖，對這些因素中交互項之間的交互效應進行分析。

圖3 Y=f（X2，X3）的響應曲面圖及其等高線圖

由圖3可以看出，響應曲面坡度相對較大，等高線呈橢圓形，表明液料比和處理時間兩者交互作用顯著。由等高線可知，沿處理時間方向等高線密集而液料比方向等高線相對稀疏，說明處理時間比液料比對響應值峰值的影響大。當處理時間在20～25 min， 液料比在10～15 mL／g范圍內，兩者存在顯著的增效作用，紫砂蕓豆花色苷提取率隨2個因素的增加而增加，當處理時間在25～30 min，液料比在15～20 mL／g范圍內，紫砂蕓豆花色苷提取率隨個因素的增加而減小。

2.3.3 最優提取條件確定

為了進一步確證最佳點的值，采用SAS軟件的Rsreg語句對試驗模型進行響應面典型分析，以獲得最大提取效果時的條件。提取率最高時的微波功率，處理時間，液料比的具體值分別為：251 W，24. min，13.7 mL／g，該條件下得到的最大的吸光度為0.32。按照最優提取條件進行試驗，重復3次（n= 3）。結果紫砂蕓豆花色苷的最大吸光度為0.32± 0.02，試驗值與模型的理論值非常接近，可見該模型能夠較好的反映出超聲／微波協同提取紫砂蕓豆花色苷的條件。

表4 二次回歸模型參數表

2.4 紫砂蕓豆花色苷的組成初步鑒定

表5、表6、表7是不同濃度乙醇洗脫液中紫砂蕓豆花色苷的組成成分分析結果。

表5 40%乙醇洗脫液的液質檢測分析結果

表6 60%乙醇洗脫液的液質檢測分析結果

表7 80%乙醇洗脫液的液質檢測分析結果

由表5、表6、表7可以看出紫砂蕓豆花色苷的種類主要有5種，分別為天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、天竺葵-3，5-二葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖-5阿拉伯糖；其中天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷含量較高，這與文獻［14-16］所述基本一致。同時根據文獻［14］所述天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷具有重要的生理活性，因此，應將紫砂蕓豆花色苷的研究集中在天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷的純化方面。通過研究發現紫砂蕓豆花色苷的主要成分天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷主要集中在40%乙醇洗脫液中，因此，在進行大孔樹脂純化紫砂蕓豆花色苷的過程中，可以先用40%的乙醇沖洗得到高純度的天竺葵素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷，然后再利用高濃度的乙醇沖洗去除雜質。

3 討論

本研究以雜糧紫砂蕓豆為原料進行紫砂蕓豆花色苷的提取，通過超聲／微波協同提取工藝的優化花色苷類物質的提取率增加10%左右，這與文獻［9-11］研究結果基本一致。并通過對紫砂蕓豆花色苷組成的成分，發現紫砂蕓豆花色苷中花色苷組成與藍莓花色苷相似，主要成分為天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷。因此，本研究認為可以利用紫砂蕓豆代替藍莓果進行花色苷的高效、經濟生產。此外，通過液質分析發現紫砂蕓豆花色苷中的天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷相對集中，主要存在于40%乙醇洗脫液中，在純化過程中可以先用40%乙醇進行洗脫得到高純度的紫砂蕓豆花色苷，再利用高濃度的乙醇去除雜質。根據這一特征結合國家先進的模擬移動床色譜分離技術原理，可以設計模擬移動床色譜純化紫砂蕓豆花色苷的工藝參數，優化技術參數，最終實現紫砂蕓豆花色苷可以實現效率、連續化的生產，實現紫砂蕓豆花色苷的產業化生產。

4 結論

4.1 紫砂蕓豆花色苷最佳提取工藝參數為：微波功率251 W，液料比13.7 mL／g，提取時間24.9 min，該條件下得到的最大的吸光度為0.32。按照試驗優化后的提取條件試驗，紫砂蕓豆花色苷的最大吸光度為0.32±0.02，此條件下的試驗值與預測值基本相符。可以認為本研究建立的模型能夠較好的反映出超聲／微波協同提取紫砂蕓豆花色苷的條件。

4.2 紫砂蕓豆花色苷的種類主要有5種花色苷物質，其中天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷含量較高，研究發現紫砂蕓豆花色苷天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷主要集中在40%乙醇洗脫液中。

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Research on Ultrasonic／Microwave Synergistic Extraction of Anthocyanins from Purple Kidney Bean and Structure Identification

Li Liangyu1Song Dawei2Diao Jingjing1Jia Pengyu1Zhang Liping1，3
（National Coarse Cereals Engineering Research Center，Heilongjiang Bayi Agricultural University1，Daqing 163319）

（College of Forestry，Northeast Forestry University2，Haerbin 150040）
（College of Food，Heilongjiang Bayi Agricultural University3，Daqing 163319）

In this paper，purple kidney bean varieties from northeast of China was taken as the raw material，the ultrasonic／microwave synergistic extraction process of anthocyanins from purple bean were studied，and the structure was identified.As indicated in the results，the optimum ultrasonic／microwave synergistic extraction process parameters of anthocyanins from purple kidney bean were shown as following：microwave power 251 W，liquid to solid ratio 13.7 mL／g，extraction time 24.9 min.Chromatographic analysis of ethanol eluent with different concentration showed that there were mainly five kinds of anthocyanins substances，in which pelargonidin 3-glucoside，peony-3-glucoside were higher by of different concentration ethanol elution liquid quality analysis，pelargonidin3-glucoside，peony prime3-glucoside mainly concentrated in 40%ethanol eluent.The research may provide reference for anthocyanin purification with macroporous resin，and as theory base for anthocyanin process and its industrial application.

purple kidney bean，anthocyanins，ultrasonic／microwave synergistic extraction，structure identification

TS214.9

A

1003-0174（2017）03-0018-07

國家科技支撐計劃（2011FU125X07）

2015-06-30

李良玉，男，1982年出生，副研究員，雜糧活性成分提純與應用

張麗萍，女，1957年出生，教授，天然活性物質提純與應用