色米提取物的抗氧化作用與成分分析研究

嚴 娜王 芳，2高雪燕崔梓荻王汝華華澤田，2

（天津科技大學食品工程與生物技術學院1，天津 300457）（天津天隆種業科技有限公司2，天津 300457）

色米提取物的抗氧化作用與成分分析研究

嚴 娜1王 芳1，2高雪燕1崔梓荻1王汝華1華澤田1，2

（天津科技大學食品工程與生物技術學院1，天津 300457）
（天津天隆種業科技有限公司2，天津 300457）

為探討色米提取物總酚含量與抗氧化相關性及其抗氧化的物質基礎，以4種不同品種的色米為材料，采用Folin-Ciocalteu法測定總酚含量，三氯化鋁比色法測定黃酮含量，DPPH·、ABTS+·清除法和O2-·清除法評價抗氧化活性，高效液相色譜法進行多酚成分分析。結果表明，4個品種的色米總酚含量范圍為42～305.2 mg GAE／g，紅米具有最高的總酚和黃酮含量以及最好的抗氧化能力，綠米各項指標均最低。提取物成分分析結果顯示，4個品種均具有一定含量的沒食子酸、兒茶素、香草酸、咖啡酸和阿魏酸。

色米 總酚 抗氧化 活性成分

稻米是我國2／3人口的主食，提高稻米營養品質及保健品質對促進我國人民的身體健康有著十分重要的作用［1］。有色稻米是色素沉積在水稻種子的種皮內形成的一種重要的特異水稻種質資源，就種皮顏色而言，可分為綠色、紫色、紅色、紫黑色、黃色、黃褐色、咖啡色和紫紅色等顏色［2］。多項研究證明有色稻米具有清除自由基、延緩衰老、抗應激反應以及免疫調節等多種生理功能，起到關鍵作用的物質主要是黃酮素、花青素、酚酸類等活性成分［3-4］。黃酮類和酚酸類物質均屬于多酚類物質，因其獨特的抗氧化活性受到越來越廣泛的關注?，F在國內外酚類物質的研究主要集中在水果和蔬菜上［5］，對于稻米中的總酚物質的研究較少，Su等［6］以白米和糙米為原料，研究其中游離酚和結合酚的成分，張名位等［7］研究了黑米提取物不同極性部位的抗氧化性和成分分析。

本試驗以不同顏色（紅色、黑色、紫色、綠色）的色米為材料，利用多種自由基體系進行抗氧化活性的研究，結果更客觀。測定多酚類物質的常用的方法有紫外分光光度法、離子色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法和毛細管電泳法等，而紫外分光光度法和薄層色譜法，只能測定總酚或某一類酚的含量，不能確定具體的種類和含量。高效液相色譜具有流動相消耗少，分析時間短，選擇性好、結果準確、靈敏性高等特點［8］，因此本試驗選用此方法進行成分測定。本試驗在優化色米抗氧化提取物制備條件的基礎上測定其抗氧化物質基礎，提高稻米的營養價值和附加值，以期為色米的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

紅米（131TZ14）、黑米（141TZ13）、紫米（141TZ16）、綠米（141LT91）：天津天隆種業有限公司。稻谷經龔谷機碾去種皮得到糙米。

沒食子酸、蘆丁、DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽）、NBT（氯化硝基四氮唑藍）、NADH（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）、PMS（吩嗪硫酸甲酯）：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；福林酚試劑：北京索萊寶生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

TE214S電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；JSP-100高速多功能粉碎機：浙江省永康市榮浩二貿有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；Alpha1-2LDPlus真空冷凍干燥機：北京五洲東方科技有限公司；EMS-19磁力攪拌器：天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

用龔谷機碾去種皮得到糙米，經過粉碎后備用。

1.2.2 色米提取物的制備

取5 g樣品，加入50 mL提取液（70%丙酮、1%乙酸、29%水），在磁力攪拌條件下常溫提取1 h，3 000 r／min離心15 min，經旋轉蒸發濃縮后冷凍干燥成粉末，以備測定抗氧化活性。每種色米提取3次，求平均提取率。樣品分析和測定用50%甲醇溶解。

1.2.3 多酚含量測定

總酚含量采用Folin-Ciocalteu（FC）法測定［9］。以50%甲醇做空白，以沒食子酸為標樣，于760 nm下測定吸光值，做標準曲線，建立的回歸方程為：Y= 1.118 6X-0.002 3（R2=0.999）?？偡雍恳悦靠颂崛∥镏兴喈斢跊]食子酸的量進行計算。

1.2.4 總黃酮含量測定

總黃酮含量采用三氯化鋁比色法測定［10］。以50%甲醇做空白，以蘆丁為標樣，于510 nm下測定吸光值，做標準曲線，建立的回歸方程為：Y=0.928 8X-0.000 3（R2=0.999 7）。總黃酮含量以每克提取物中所含相當于蘆丁的量進行計算。

1.2.5 DPPH·清除能力測定［11］

取50 μL適當濃度樣品溶液和3 mL 0.1 mmol／L 的DPPH甲醇溶液，充分混勻后于室溫下密封避光靜置60 min，以50%甲醇做空白，于517 nm下測吸光值。DPPH清除率計算公式：DPPH清除率=（A0-A1）／A0×100%，式中：A0為對照管的吸光度值；A1為樣品管的吸光度值。

1.2.6 ABTS+·清除能力測定［12］

使用前將濃度為7 mmol／L的 ABTS溶液與2.45 mmol／L過硫酸鉀溶液按1∶1混合，室溫避光放置16～24 h，制得ABTS+儲存液，臨用前用乙醇稀釋混合液，稀釋終點用混合液的吸光值來判斷，當吸光值為A734為0.700±0.02時即可。

移取50 μL樣品溶液，加入3 mL的ABTS+工作液，混合，室溫下避光反應30 min，以50%甲醇做空白，測定其在734 nm處吸光值。ABTS+清除率計算公式為：ABTS+清除率 =（A0-A1）／A0×100%，式中：A0為空白管的吸光度值，A1為樣品管的吸光度值。

1.2.7 SOR自由基清除能力［13］

該反應于96孔板中進行，依次加入50 μL的樣品提取液、50 μL的 NBT（200 μmol／L）、50 μL的NADH（624 μmol／L）以及50 μL的PMS（80 μmol／L），于室溫下反應5 min，用酶標儀于560 nm下測定吸光值。PMS用pH為7.4的0.1 mol／L的PBS現用現配，以PBS為陰性對照。SOR清除率計算公式為：SOR清除率=［1-（Asample／Acontrol）］×100%。

1.2.8 高效液相色譜測定抗氧化成分［14］

樣品在液相前過0.22 μm有機濾膜。色譜柱：Waters C18（5.0 μm 4.6×250 mm）。檢測波長270 nm，流速：0.7 mL／min，進樣體積：10 μL，柱溫：30℃。流動相A：1 000 mL水+7 mL甲酸。流動相B：500 mLACN（乙腈）+500 mL水+7 mL甲酸。

HPLC設定條件如表1所示。

表1 HPLC的設定條件

2 結果與分析

2.1 色米提取物得率及總酚、總黃酮含量

表2顯示4種色米提取物得率在1%～4%之間，得率相差不大。不同品種之間總酚含量和黃酮含量存在顯著差異（P＜0.05），其中紅米的總酚及黃酮含量均最高，綠米的總酚及黃酮含量較低，而綠米提取得率較高的原因可能是提取物中含有多糖類物質［15］。

表2 4種色米提取物的得率及總酚、黃酮含量

2.2 色米提取物清除自由基能力測定

清除自由基研究方法主要有電子自旋共振法、高效液相色法、化學發光法、分光光度法等，本研究采取分光光度法進行測定，操作簡單，不需要特殊的檢測設備，因此常被選作抗氧化性能評價的方法。不同的抗氧化體系，其機理有所不同，一般選擇多種抗氧化體系進行測定，常見的有 DPPH、ABTS等。

由圖1可以看出，4種色米提取物在相同濃度下對DPPH自由基、ABTS自由基、SOR自由基的清除能力存在顯著性差異（P＜0.05）。紅米提取物對3種自由基清除能力最大，綠米最小，其清除能力順序：紅米＞黑米＞紫米＞綠米，其清除能力趨勢與相應的多酚黃酮含量一致，可推測色米提取物清除自由基能力與其多酚類化合物的含量有關。原因可能是色米提取物中所含多酚含量越多，抗氧化性物質越多，清除自由基的能力也就越強［16］。另外，多酚類化合物作為一類氧化還原電位很低的還原劑，具有很強的供氫能力，H+與自由基結合，能使之還原為惰性化合物或較穩定的自由基，4種色米提取物中綠米的供氫能力較?。?7-18］。

圖1 不同樣品清除自由基能力

注：字母相同表示差異不顯著（P＞0.05），字母不相同表示差異顯著（P＜0.05）。

2.3 高效液相色譜測定抗氧化成分

在已確定的色譜條件下，分別將不同濃度的標準溶液進樣分析，根據峰面積與標準物質的含量關系進行線性回歸如下表格。在各相應的線性范圍內，相關系數R2＞0.99，表明線性關系良好。

表3 標準曲線的回歸分析和檢測方法的相關數據

將圖3與圖2對照，確定色米水稻多酚中含有沒食子酸、兒茶素、香草酸、咖啡酸和阿魏酸（以紫米為例）。

常見的稻米多酚按照化學結構不同主要分有黃酮類、酚酸類等。其中兒茶素屬于黃酮類物質，沒食子酸、香草酸、咖啡酸、阿魏酸屬于酚酸類。本試驗樣品中各酚類物質的含量以峰面積查相應的標準曲線求得，結果見表4。紅米在4種物質中含量均最高，除咖啡酸和阿魏酸以外，綠米含量均最低。另外，紅米和黑米中咖啡酸最多，紫米和綠米兒茶素含量最多。從樣品譜圖看出，有幾個較明顯的峰沒有找到其對應標品，需要進一步的純化來大致確定其所屬類型。

圖2 色米提取物標準品的譜圖

圖3 色米（紫米）提取物的HPLC譜圖

表4 4種有色米所含成分的含量差異／mg／mg

3 討論與結論

4種色米總酚含量均具有顯著性差異，以紅米的含量最高為305.4 mg／g，其次是黑米、紫米、綠米此結論與Shen等［19］的結論稍有不同，原因可能是稻米多酚有游離態，結合態與酯化態形式存在，而不同處理方式（如堿性、酸性或者酶的作用下［20］）提取得到的成分有所不同。

本研究中色米提取物成分結果分析得出酚酸類物質比黃酮類物質含量要高，與有關報道有相似之處［21］。本試驗檢測出了沒食子酸、香草酸、咖啡酸阿魏酸、兒茶素 5種物質，從液相譜圖看出，在35～40 min出現較大的峰面積，說明提取物中含有未知的單體黃酮，需要進一步研究，以確定其成分。

稻米多酚具有較明顯的抗氧化作用，其抗氧化作用隨著色米總酚含量的增加而提高，這一結論與國內外研究結論一致。試驗中色米提取物的總酚含量與DPPH·、ABTS+·清除能力、超氧陰離子自由基之間有顯著的相關關系。本研究色米品種較多，不只集中在黑米的研究上［7，22］。為了進一步探究其抗氧化物質基礎，可以采用液質聯用等方法進行提取物的結構分析，確定其中起到關鍵作用的基團種類。

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Research on Antioxidant Effect and Composition Analysis of Colored Rice Extracts

Yan Na1Wang Fang1，2Gao Xueyan1Cui Zidi1Wang Ruhua1Hua Zetian1，2
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology1，Tianjin 300457
（Tianjin Tianlong Seeds Science and Technology Co.，Ltd.2，Tianjin 300457）

In order to discuss correlation between the total phenolic content and the antioxidant activity in col ored rice and the material basis of antioxidant activity，based on using four different varieties of colored rice as materi als，the total phenolic content was determined by Folin-Ciocalteu method，the flavonoid content was determined by al chlor colorimetric method，the antioxidant activity was evaluated by DPPH·，ABTS+·clearance assay and，O2-· clearance assay，high performance liquid chromatography（HPLC）method was used for polyphenol content analysis Results indicated that the total phenolic content of the four colored rice was in the range of 42～305.2 mg GAE／g. Red rice exhibited the highest total phenolic and flavone content and the best antioxidant properties，while the gree rice was the lowest.Extract components analysis results showed that the four varieties had certain content of galli acid，catechin，vanillic acid，caffeic acid and ferulic acid.

colored rice，total phenols，antioxidant，active ingredients

TS213.3

A

1003-0174（2017）03-0001-05

863計劃（2011AA10A101），天津市教委項目（2013 0616），天津市科技特派員項目（15JCTPJC57400）

2015-08-12

嚴娜，女，1989年出生，碩士，糧油資源與生物技術

王芳，女，1975年出生，副教授，功能性谷物