PTPN22和轉錄因子FOXP3基因多態性與系統性紅斑狼瘡遺傳易感性的關聯性分析

李聲東

[摘要] 目的 探討蛋白酪氨酸磷酸酶22（PTPN22）和轉錄因子FOXP3基因多態性與系統性紅斑狼瘡（SLE）遺傳易感性的關聯性。 方法 選取2013年1～6月我院收治的系統性紅斑狼瘡患者80例為研究組，選取同期健康體檢人員80例為對照組，對比兩組研究對象的PTPN22和轉錄因子FOXP3基因多態性。 結果 FOXP3位點基因頻率在兩組研究對象當中的分布存在明顯區別（P<0.05）；FOXP3基因-2383C/T同-3281C/A存在連鎖不平衡，-2383T/-3281A的單倍型攜帶者明顯加大SLE發病的風險（P<0.05）； PTPN22基因-1123G/C位點的等位基因以及基因型分布在兩組研究對象之間無明顯差異（P>0.05）。 結論 FOXP3基因-2383C/T的多態性同SLE發生發展之間存在顯著的關聯性，并且-2383T基因可能是該病重要的遺傳易感基因，同時PTPN22基因位點1858C/1858T以及-1123G/C同SLE發病無明顯關聯性。

[關鍵詞] PTPN22；轉錄因子FOXP3；基因多態性；系統性紅斑狼瘡；遺傳易感性

[中圖分類號] R593.241 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）05-0001-04

系統性紅斑狼瘡（SLE）屬于免疫性疾病的一種，主要特點是免疫物沉積到皮膚、腎臟、神經系統以及血管當中，導致炎癥以及壞死問題[1]。研究人員發現SLE患者的T細胞存在調節障礙并且合并有免疫功能方面的紊亂。這些免疫缺陷與患者T細胞功能以及數量方面的障礙存在聯系[2]。FOXP3是T細胞的重要轉錄因子，在SLE的發生以及發展過程當中可能發揮重要影響。FOXP3基因在X染色體，分子生物學的研究結果顯示FOXP3基因有著多態性，與多種免疫性疾病存在聯系[3]。蛋白酪氨酸磷酸酶22（PTPN22）是近年來受到研究人員高度重視的免疫疾病基因，編碼在T細胞傳導途徑當中，通過脫磷酸化作用影響T細胞的轉導，從而抑制免疫性疾病出現[4]。本研究分析PTPN22以及FOXP3基因多態性與SLE之間的關系，從而為分析系統性紅斑狼瘡遺傳易感性提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2013年1～6月我院收治的系統性紅斑狼瘡患者80例為研究組，男16例，女64例，年齡22～45歲，平均（35.1±2.6）歲，所有患者均符合美國風濕病協會的SLE診斷標準。選取同期健康體檢人員80例為對照組，男18例，女62例，年齡23～44歲，平均（35.3±2.9）歲。兩組患者的一般資料有可比性（P>0.05），本研究得到醫院倫理委員會批準，患者知情同意。

1.2方法

1.2.1 PTPN22檢驗方法 采集患者的靜脈血5 mL，EDTA抗凝之后，使用碘化鈉法提取基因組DNA后保存備用。根據GenBank序列設計2對引物，特異性擴增FOXP3基因當中包含-3281C/3281A的DNA片段，取擴增產物2 L，37℃條件下孵育2 h，反應終止之后EB染色，染色之后使用凝膠成像判斷結果[5]。

1.2.2 轉錄因子FOXP3檢驗方法 采集患者的靜脈血5 mL，EDTA（乙二胺四乙酸二鈉鹽）抗凝之后使用蛋白酶抽提法提取DNA，使用DNA電泳法以及紫外分光法定量定性檢測之后保存備用。電泳酶切反應1858C/1858T位點的基因擴增產物，消毒雙蒸水2 h之后存儲在37℃的水浴箱過夜，酶切后產物進行凝膠電泳分析，電泳之后將凝膠放到EB液當中染色1 h之后觀察拍照[6]（封三圖1）。

1.3統計學方法

讀取個體樣本之后計算基因型以及等位基因頻率，確認是否符合平衡定律，對等位基因頻率以及多態性位點的基因型頻率進行檢驗[7]，數據用SPSS18.0軟件分析，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1兩組患者FOXP3基因多態性分布頻率比較

FOXP3位點基因頻率在兩組研究對象當中的分布存在明顯差異（P<0.05），見表1。

2.2兩組患者FOXP3基因單倍型分布頻率比較

FOXP3基因-2383C/T同-3281C/A存在連鎖不平衡，-2383T/-3281A的單倍型攜帶者明顯加大SLE發病的風險（P<0.05），見表2。

2.3兩組PTPN22基因啟動子-1123G/CSNP位點的等位基因以及基因型分布頻率比較

PTPN22基因啟動子區域-1123G/CSNP在各組內男女之間三種基因型頻率分布無明顯差異（P>0.05），C等位基因的分布及CC基因型的頻率在研究組和對照組之間分布也無明顯差異（P>0.05），見表3。

3 討論

系統性紅斑狼瘡是各種因素聯合作用誘發的一種免疫功能失調疾病，當前情況下人們對該病的致病因素尚未完全明確，但是研究人員普遍認為細胞免疫功能在SLE的發病過程當中有不容忽視的影響。SLE患者的β細胞功能活化同時大量產生自身抗體，似乎SLE是β細胞異常誘發的疾病，不過β細胞的活化受T細胞異常的誘導與影響，因此SLE更像是T細胞介導的一種疾病[8]。FOXP3是foxhead的家族成員，在人體的CD4+以及CD25+T細胞當中都有表達，并且可以介導二者在胸腺當中的發育、功能維持以及外周表達[9]。相關研究的結果顯示，FOXP3基因的突變或者是小鼠體內兩種T細胞數量的減少，能夠誘發比較嚴重的免疫性疾病[10]。當前FOXP3在SLE發病過程當中具體影響的研究還比較少見。有研究人員在小鼠的狼瘡模型當中檢測CD4+以及CD25+T細胞以及FOXP3表達，結果顯示狼瘡小鼠當中的CD4+以及CD25+T細胞表達要明顯少于正常的小鼠[11]。還有研究人員發現在SLE患者的外周血細胞當中，FOXP3RNA水平明顯下降。因此可以認為FOXP3在SLE發病過程當中可能會發生重要影響[12]。FOXP3的基因在X染色體的短臂，包括10個內含子以及11個外顯子。研究顯示FOXP3基因有著遺傳多態性，這一特點給FOXP3基因表達以及轉錄帶來直接的影響，從而在一定程度上決定著生物學功能，同部分自身免疫疾病存在密切聯系[13]。因此有研究人員推測FOXP3的基因多態性同SLE的易患性存在聯系[14]。在FOXP3基因的多態性以及SLE之間的關系方面，還缺乏系統深入的研究。為進一步分析FOXP3的基因多態性同該病發生發展的聯系，本研究對比健康人群以及SLE患者，分析FOXP3的基因多態性，結果表明SLE患者的-2383C/T在多態性分布方面同健康人員比較而言有明顯差異，T等位基因的攜帶頻率在SLE患者當中要明顯多于健康人群（P<0.05）。聯合基因型分析結果顯示發現，-2383T/-3281A的等位基因明顯加大了SLE的發病風險。這意味著FOXP3基因的-2383C/T多態性同該病的發作有明顯關聯性，并且-2383T等位基因推測是SLE患者的遺傳易感基因。FOXP3基因當中的-3281C/A多態性同SLE的發生發展無明顯相關性。

PTPN22在1號染色體當中，共有15個內含子以及16個外顯子，編碼酪氨酸磷酸酶（LYP）[15]。LYP集中分布在人體的淋巴細胞當中，由含有脯氨酸基序（C端）以及磷酸酶區域（N端）組成。在T細胞的活化步驟當中，借助于C端名為P1的氨酸基序同Csk結構相連接而發揮調節功能，使得磷酸化的酪氨酸激酶能夠脫磷酸化從而喪失活性，抑制T細胞信號通路的激活，通過這樣的途徑調節T細胞信號[16]。單核苷酸的變異會導致信號轉導出現障礙，從而誘發免疫性疾病的出現以及惡化。相關研究的結果表明，截止到目前為止，亞洲地區還滅有出現基因位點出現變異的狀況[17]。雖然該位點的研究數量比較多，不過主要為國外研究結果，同時實驗的對象也主要是歐美白種人。當前國內研究人員在這一位點的研究大部分都同免疫甲狀腺炎先關，同SLE有聯系的研究比較少[18]。為進一步分析這一位點同SLE發病之間的聯系，本研究選取SLE患者行了研究，結果并未檢測患者當中存在T等位基因的變異。除此之外，我國其他研究人員的相關實驗結果顯示，CT基因型僅僅存在于錫伯族、蒙古族、赫哲族、回族、哈薩克族以及維族等少數民族當中[19]。本研究當中，我們研究基因啟動子區域的-1123G/C位點同SLE發病之間的聯系，結果表明該位點的3種基因型具體分布方面，研究組SLE患者以及對照組健康人群之間差異無統計學意義（P>0.05），兩組患者當中C等位基因頻率也沒有顯著差異（P>0.05）。因此可以認為該位點多態性同SLE發病之間不存在相關性。

在PTPN22的基因多態性同狼瘡性腎炎之間的關系方面，狼瘡性腎炎可以說是SLE的常見并發癥之一，發病同多種基因存在聯系[20]。研究人員根據是否存在狼瘡性腎炎分組研究例西班牙的SLE患者，結果并未發現PTPN22在不同患者之間的明顯區別，因此認為PTPN22的多態性對狼瘡性腎炎并無直接的影響，推測是因為自身免疫疾病發生的基因基礎比較復雜，PTPN22出現只是基因變異比較微弱的組成部分[21]。PTPN22的基因多態性同自身抗體之間的關系方面，有研究人員認為在多發性硬化以及其他自身免疫疾病當中缺乏明確的證據，推測該基因在抗體產生過程當中有重要的影響[22]。當前已知存在三種不同的自身免疫疾病抗體同PTPN22有明確的聯系，例如I型糖尿病患者的抗谷氨酸抗體、RA患者的抗心磷脂抗體以及RF患者的自身抗體，推測PTPN22的變異借助于易化疾病抗體而導致患者出現自身免疫疾病。

國內研究人員采取同本研究類似的方法，研究自身免疫性的甲狀腺患者，分析患者的位點情況，結果顯示該位點在等位基因以及基因型的分布頻率方面，同健康人對比存在明顯差異，因此認為PTPN22啟動子-1123G/C位點的多態性同免疫性甲狀腺的發生發展存在重要的聯系，并且同CTLA-4基因G等位基因存在互相協同的效果[23]。當前情況下，人們還不確定-1123G/C對于功能異常的影響，有人分析該位點附近的DNA序列，結果顯示-1123G同轉錄因子激活蛋白4的結合位點較為匹配。其中后者屬于螺旋-環-拉鏈家族。-1123G/C在激活蛋白4序列當中的中心位置，-1123C基因無法同已知的各種轉錄因子實現結合[24]。所以PTPN22當中的-1123C會影響到轉錄的效率，使得患者發生自身免疫性的疾病，PTPN22的雜合優勢同表達調節存在一定的聯系[25]。本研究并未發現其SLE患者的發病同GC基因型的優勢相關，推測可能同樣本數量多少、不同疾病類型以及位點易感基因不同的影響因素相關，還需要后續的研究加以證實。

綜上所述，FOXP3基因-2383C/T的多態性同SLE發生發展之間存在顯著的關聯性，并且-2383T基因可能是該病重要的遺傳易感基因，同時PTPN22基因位點1858C/T以及-1123G/C同SLE發病無明顯關聯性。

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（收稿日期：2016-11-11）