Ras同源物基因家族成員B對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移能力的影響

陳偉浩，徐衍盛，歐陽(yáng)昀，王希友，吳意光，張新宇，王 毅，周茂軍，趙豫波，關(guān)維民，劉萃龍

Ras同源物基因家族成員B對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移能力的影響

陳偉浩，徐衍盛，歐陽(yáng)昀，王希友，吳意光，張新宇，王 毅，周茂軍，趙豫波，關(guān)維民，劉萃龍

目的研究干擾Ras同源物基因家族成員B(Ras homolog gene familymember B，RhoB)表達(dá)后對(duì)腎透明細(xì)胞癌(renal clear cell carcinoma，RCCC)細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移能力的影響。方法檢測(cè)RhoB在RCCC細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染RhoB真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Flag-RhoB和沉默RhoB的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)即si-RhoB序列及相應(yīng)空載體和對(duì)照序列，應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后RhoB的蛋白表達(dá)情況，通過(guò)3-(4，5-二甲基吡啶-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，MTS]法、平板克隆和Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果RhoB在RCCC細(xì)胞中表達(dá)降低。與轉(zhuǎn)染空載體組比較，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-Flag-RhoB重組質(zhì)粒組RhoB的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)；與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，si-RhoB轉(zhuǎn)染組RhoB的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。在RCCC細(xì)胞786-O和Caki-1中，上調(diào)RhoB的表達(dá)后，在4、5、6 d經(jīng)MTS法測(cè)定光密度值明顯降低(P＜0.05)；在786-O細(xì)胞中上調(diào)RhoB表達(dá)后細(xì)胞克隆數(shù)明顯減少；轉(zhuǎn)染48 h后Transwell細(xì)胞遷移數(shù)明顯減少(P＜0.05)。而下調(diào)RhoB表達(dá)后，細(xì)胞生長(zhǎng)和Transwell細(xì)胞遷移數(shù)沒(méi)有明顯變化。在相對(duì)高表達(dá)RhoB的正常人腎小管上皮細(xì)胞中下調(diào)RhoB表達(dá)后細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞遷移數(shù)明顯增多。結(jié)論 過(guò)表達(dá)RhoB后明顯抑制RCCC細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移能力。

Ras同源物基因家族成員B；腎透明細(xì)胞癌；細(xì)胞生長(zhǎng)；遷移

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于膀胱癌，其中60%～85%的病理分型為腎透明細(xì)胞癌(renal clear cell carcinoma，RCCC)[1]。Ras同源物基因家族成員B(Ras homolog gene familymember B，RhoB)是Rho亞家族中一個(gè)較為獨(dú)特的分子，是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要因子，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架、細(xì)胞間黏附及細(xì)胞的轉(zhuǎn)化等活動(dòng)，進(jìn)而在調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和遷移等方面發(fā)揮重要作用[2]。目前，RhoB在RCCC的生物學(xué)功能鮮見(jiàn)報(bào)道。作者通過(guò)干擾RhoB在RCCC細(xì)胞中的表達(dá)水平，初步探討RhoB對(duì)RCCC細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 正常人腎小管上皮細(xì)胞(human kideny tubular epithelial cell，HKC)和 RCCC細(xì)胞 786-O、769-P、Caki-1均為解放軍總醫(yī)院泌尿外科實(shí)驗(yàn)室保存。10%胎牛血清、無(wú)血清Opti-Mem培養(yǎng)基(伊格爾最低限度必需介質(zhì)培養(yǎng)基改良型)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’smedium，DMEM)、洛斯維-帕克紀(jì)念研究所(Royal Park Memorial Institute，RPMI)1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；蛋白裂解液試劑盒、二辛可寧酸蛋白定量試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠制備試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)；聚偏二氟乙烯膜(美國(guó)Bio-Rad公司)；封閉用脫脂奶粉(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；化學(xué)發(fā)光底物試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；沉默RhoB的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)即si-RhoB序列和對(duì)照序列為上海吉瑪公司合成；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM(美國(guó)Invitrogen公司)；磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液(Tris buffered saline，TBS)/0.1% Tween-20(TBST)及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志的兔抗羊免疫球蛋白G(北京中杉金橋公司)；兔抗人RhoB (武漢三鷹公司)；3-(4，5-二甲基吡啶-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，MTS]試劑盒(美國(guó)Promega公司)；Transwell小室(美國(guó)Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 RhoB重組質(zhì)粒pcDNA3.0-Flag-RhoB為前期實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。si-RhoB序列:上游引物5′-ACGUCAUUCUCAUGUGCUUTT-3′、下游引物5′-AAGCACAUGAGAAUGACGUTT；對(duì)照序列:上游引物5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′、下游引物5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。培養(yǎng)細(xì)胞處于增殖期時(shí)，以每孔2 000個(gè)細(xì)胞的密度平鋪于6孔板培養(yǎng)皿上，至細(xì)胞覆蓋率達(dá)到70%～80%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000TM說(shuō)明書(shū)分別將pcDNA3.0-Flag-RhoB及空載體和si-RhoB及對(duì)照序列儲(chǔ)存液與Lipofectamine 2000TM混合于Opti-Mem中制成轉(zhuǎn)染液，最后分別將各組混合好的轉(zhuǎn)染液按分組加入6孔板培養(yǎng)皿，每次處理重復(fù)3次。

1.2.2 Western Blot法檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，使用蛋白裂解液試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白，采用二辛可寧酸法測(cè)定蛋白濃度。提取蛋白經(jīng)沸水煮10 min加熱變性后，按蛋白量為每孔50 μg加樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(12%分離膠、5%濃縮膠)，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入一抗兔抗人RhoB(1∶1 000稀釋)，4℃封閉過(guò)夜；TBST洗膜3次，每次10 min，再加入1∶3 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志的二抗及β-actin室溫孵育1 h；應(yīng)用TBST洗膜3次，每次10 min，然后加入化學(xué)發(fā)光底物，暗室中用X線片曝光后，經(jīng)英國(guó)Uvitec公司凝膠成像系統(tǒng)攝像；采用Image-Pro Plus 7.0軟件分析條帶的灰度值，以RhoB/β-actin代表 RhoB的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 MTS法和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)能力 實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-Flag-RhoB的重組質(zhì)粒組、空載體組，si-RhoB組及對(duì)照組，每組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔，收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，按照每孔5 000個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，在37℃、5% CO2孵育，1、2、3、4、5、6 d后每孔加20μL MTS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀上選擇490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光密度值。計(jì)算6孔平均值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液在10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中備用。將各組細(xì)胞按照每孔400個(gè)細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周；當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)終止培養(yǎng)，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液小心浸洗2次，加4%多聚甲醛固定細(xì)胞；然后棄去固定液，加適量基姆薩染色10～30 min；最后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。顯微鏡下進(jìn)行陽(yáng)性克隆計(jì)數(shù)(超過(guò)50個(gè)克隆細(xì)胞)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力 實(shí)驗(yàn)按分組，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞計(jì)數(shù)后用含1%胎牛血清的DMEM重懸，調(diào)整細(xì)胞至2 000/mL，每組加100μL細(xì)胞懸液(含2×104個(gè)細(xì)胞)在Transwell小室，下室加入含10%胎牛血清的DMEM 500μL作為趨化因子，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后取出Transwell小室吸干其中的液體，4%多聚甲醛固定30 min后用結(jié)晶紫染色；用棉簽擦凈小室底部，將小室倒過(guò)來(lái)背朝上晾干后于顯微鏡下拍照，隨機(jī)取10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)隨機(jī)視野中的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RhoB在RCCC細(xì)胞中的蛋白表達(dá) 與HKC比較，RhoB在RCCC細(xì)胞中的蛋白表達(dá)明顯降低(圖1)。

2.2 RhoB對(duì)RCCC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 與轉(zhuǎn)染空載體組比較，RhoB在重組質(zhì)粒組中的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(圖2A)；與對(duì)照組比較，RhoB在si-RhoB組中的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(圖2B)。與轉(zhuǎn)染空載體組比較，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組在轉(zhuǎn)染后4、5、6 d經(jīng)MTS法測(cè)定光密度值明顯降低；而下調(diào)RhoB的表達(dá)后786-O、Caki-1細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯變化(圖2C、D)。在HKC中下調(diào)RhoB的表達(dá)后，可促進(jìn)HKC的生長(zhǎng)能力(圖2E)。過(guò)表達(dá)RhoB后重組質(zhì)粒組細(xì)胞的克隆數(shù)較空載體組明顯減少(P＜0.05，圖2F)。

2.3 RhoB對(duì)RCCC細(xì)胞遷移能力的影響 轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-Flag-RhoB的重組質(zhì)粒組的細(xì)胞遷移數(shù)較轉(zhuǎn)染空載體組明顯減少，而在轉(zhuǎn)染si-RhoB組及轉(zhuǎn)染對(duì)照組的細(xì)胞遷移數(shù)沒(méi)有明顯變化(圖3A)。在HKC中下調(diào)RhoB的表達(dá)，si-RhoB組的細(xì)胞遷移數(shù)明顯增多(圖3B)。

3 討論

RCC是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，占成人惡性腫瘤的2%～3%，其中RCCC是腎癌中最常見(jiàn)的一種病理分型，惡性程度比較高，容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。腎癌早期無(wú)明顯臨床癥狀，目前臨床診斷主要依靠B超、CT或磁共振等影像學(xué)檢測(cè)，缺乏有效的腫瘤標(biāo)志物用于早期診斷。由于RCC對(duì)放療和化療不敏感，其主要治療方式為根治性腎切除，但術(shù)后仍有部分患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。而近年來(lái)應(yīng)用于臨床的靶向藥物也暴露出一些問(wèn)題，如費(fèi)用較高、易產(chǎn)生耐藥性、不良反應(yīng)較多等[4]。因此，尋找能夠早期診斷、治療及預(yù)測(cè)預(yù)后的RCCC的分子標(biāo)志物，是目前亟待解決的問(wèn)題。

Rho家族屬于小G蛋白家族成員，相對(duì)分子質(zhì)量為(20～25)×103。RhoB是Rho家族中的一個(gè)較為獨(dú)特的分子，雖然與RhoA、RhoC有高度的同源性，但在細(xì)胞定位、細(xì)胞表達(dá)及功能等方面有較大差異[5]。研究發(fā)現(xiàn)，RhoB在肺癌、胃癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)降低或缺失[6-8]；在卵巢癌中過(guò)表達(dá)RhoB可通過(guò)激活內(nèi)在凋亡級(jí)聯(lián)效應(yīng)誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，而且明顯抑制卵巢癌移植瘤的生長(zhǎng)[9]。研究表明，下調(diào)RhoB的表達(dá)可通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶信號(hào)通路促進(jìn)人支氣管細(xì)胞的遷移和侵襲[10]，而在未分化甲狀腺癌中再激活RhoB的表達(dá)是抑制腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。說(shuō)明RhoB在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中作為抑癌基因發(fā)揮重要作用。

本研究首先檢測(cè)RhoB在RCCC細(xì)胞中的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常HKC相比，RhoB在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低，這與RCCC組織中的表達(dá)相一致。選用RCCC細(xì)胞786-O和Caki-1，通過(guò)轉(zhuǎn)染RhoB真核表達(dá)載體及si-RhoB序列上調(diào)和下調(diào)RhoB的表達(dá)，采用MTS法、細(xì)胞平板克隆方法和Transwell小室方法檢測(cè)干擾RhoB的表達(dá)后腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移能力的變化，發(fā)現(xiàn)上調(diào)RhoB的表達(dá)后抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移能力，而下調(diào)RhoB的表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移能力沒(méi)有明顯影響。作者認(rèn)為RhoB在RCCC細(xì)胞中表達(dá)極低，降低RhoB的表達(dá)后對(duì)其生物學(xué)行為沒(méi)有明顯影響。因此，在相對(duì)高表達(dá)RhoB的HKC中下調(diào)RhoB的表達(dá)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的變化，結(jié)果顯示下調(diào)RhoB的表達(dá)后促進(jìn)HKC的生長(zhǎng)和遷移能力。本研究顯示過(guò)表達(dá)RhoB后明顯抑制腎癌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞遷移能力，說(shuō)明RhoB在腎癌的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，但具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

圖1 RhoB在RCCC細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

圖2 RhoB對(duì)RCCC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖3 RhoB對(duì)RCCC細(xì)胞遷移能力的影響

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(收稿日期:2016-10-08 本文編輯:徐海琴)

The effect of Ras homolog gene fam ily member B on cell grow th activity and m igration of renal clear cell carcinoma

CHENWeihao，XU Yansheng，OUYANG Yun，WANG Xiyou，WU Yiguang，ZHANG Xinyu，WANG Yi，ZHOU Maojun，ZHAO Yubo，GUANWeimin，LIU Cuilong
(Department of Urology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

ObjectiveTo study the effect of Ras homolog gene familymember B(RhoB)on cell growth activity and migration of renal clear cell carcinoma(RCCC).M ethodsThe protein expression of RhoB was detected in RCCC cell lines.Liposome-mediated method was used to transfect pcDNA3.0-Flag-RhoB vector or pcDNA3.0-Flag empty vector，and small interfering RNA(siRNA) targeting RhoB or negative control oligo into the clear cell renal cell carcinoma cell line 786-O and Caki-1 cells.RhoB protein expression levels after transfection were detected by Western Blot.3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS)，cell plate colony and Transwell assayswere used to detect changes in cell growth and cellmigration.ResultsRhoB was low-expression in RCCC cell lines.Compared to empty vector group and siRNA control group，the protein levels of pcDNA3.0-Flag-RhoB and siRNA RhoB group were significantly upregulated and down regulated(P＜0.05)respectively.In the groups of 786-O and Caki-1 cells，MTS assay showed the absorbance was significantly decreased respectively in pcDNA3.0-Flag-RhoB group at time of the 4，5，6 day after transfection，and the cell colony number was remarkably decreased after upregulation of RhoB in 786-O cells.Transwell assay showed the cellmigration numbers in pcDNA3.0-Flag-RhoB group were significantly decreased after 48-hour transfection(P＜0.05). By contrast，the cells transfected with si-RhoB didn’t differ in terms of cell growth and cellmigra-tion.In the relative high expression RhoB of the human kideny tubular epithelial cell cells，down regulation of RhoB significantly promoted the cell growth and cellmigration ability.ConclusionOverexpression of RhoB remarkably inhibited the cancer cell proliferation and also reduced themigration ability of RCCC.

Ras homolog gene family member B(RhoB)；Renal clear cell carcinoma (RCCC)；Cell growth；Migration

R737.11；Q51

A

2095-3097(2017)02-0080-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.02.004

2016-12-10 本文編輯:張?jiān)谖?

海軍總醫(yī)院創(chuàng)新培育基金(CXPY201423)

100048北京，海軍總醫(yī)院泌尿外科(陳偉浩，徐衍盛，歐陽(yáng)昀，王希友，吳意光，張新宇，王 毅，周茂軍，趙豫波，關(guān)維民，劉萃龍)

王希友，E-mail:510198870＠qq.com