大鼠腦出血后72 h腦組織的定量蛋白質組學分析

李曉芳，楊國鋒，劉 麗，王魯寧

大鼠腦出血后72 h腦組織的定量蛋白質組學分析

李曉芳，楊國鋒，劉 麗，王魯寧

目的鑒定大鼠腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后的差異蛋白，分析它們在ICH中的病理生理機制，為進一步篩選特異性功能相關蛋白和藥物靶點提供線索。方法制作大鼠ICH模型，應用雙向凝膠電泳和基質輔助激光解析/電離飛行時間串聯質譜技術和Western Blot法，鑒定大鼠ICH后72 h腦組織和正常腦組織的差異蛋白并進行驗證。結果在18次重復實驗中，共鑒定出39種差異蛋白，其中上調蛋白15種、下調蛋白24種。應用Western Blot法對其中2種關鍵性蛋白進行了驗證。這些差異蛋白涉及細胞骨架、能量代謝酶類、細胞凋亡等方面。結論細胞骨架蛋白與ICH的發病機制密切相關，為探索ICH的病理生理過程和治療靶點提供關鍵信息和理論依據。

腦出血；蛋白質組學；質譜；細胞骨架蛋白；大鼠

原發性腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一種導致高病死率和高致殘率的腦血管病。僅美國每年就有80 000人受到此類疾病困擾，其中只有不到1/3的患者可以恢復正常[1]，中國人口患ICH的比例更高[2]。但目前對于ICH的治療仍無突破性的進展，所以研究ICH的病理生理機制對于尋找行之有效的治療方法就顯得尤為重要。ICH對腦組織的損害大致分為2個階段:第一階段是血液從破裂的血管溢出，對原本正常的腦組織形成機械擠壓并升高局部的顱內壓[3]；第二階段是基于顱內血腫的存在而引起的一系列相應的病理生理過程的損害[4]。目前，應用蛋白質組學方法分析ICH后生物標志物及蛋白的變化而明確其病理生理機制及尋找有效治療藥物的研究很有限。Ren等[5]采用液相色譜法-質譜聯用的方法對比大鼠ICH和腦梗死后3 h的蛋白質的動態變化，鑒定出86種蛋白，揭示了ICH早期血腫周圍蛋白的變化。Chiu等[6]應用雙向凝膠電泳和質譜法分析檢測了大鼠ICH模型的血糖正常組和高血糖組，共發現8種差異蛋白，其中白蛋白在ICH急性期的保護作用與血糖水平相關；血糖正常組白蛋白廣泛上調表達，但在高血糖組未發現此蛋白。Walsh等[7]采集ICH、腦梗死患者發病12 h內的血液樣本，并設置正常對照組，發現載脂蛋白A-1和對氧磷酶1在腦梗死組降低，且兩者在腦梗死和ICH組有不同表達。但是有關ICH后第二階段血腫周圍腦組織中蛋白的變化有待進一步探索。本研究采用雙向凝膠電泳和基質輔助激光解吸/電離飛行時間串聯質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flightmass spectrometry，MALDI-TOF/TOFMS)的定量蛋白質組學方法，對大鼠ICH后72 h血腫周圍腦組織與正常腦組織進行對比分析，研究血腫周圍腦組織蛋白的動態變化情況，旨在發現ICH急性期腦組織損害的關鍵性蛋白，探討ICH后第二階段的病理生理過程，為尋找有效治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康雄性Wistar大鼠12只，體重(300±10)g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供[SCXK-(軍)-2012-0004]，分為ICH后72 h組(ICH組)和正常對照組，每組6只。

1.1.2 主要儀器及試劑 307-6型臺式牙鉆車(上海醫療器械有限公司齒科醫械廠)；立體定向儀(SN-2，日本Narishige公司)；Ettan IPGphor 3等電聚焦電泳系統(瑞典Pharmacia公司)；MALDI-TOF/ TOF質譜儀UltraFlex(德國Bruker公司)；ImageMaster 2D Elite圖像分析軟件(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司)；pH值3～10非線性24 cm固相pH梯度預制干膠條(瑞典Pharmacia公司)；三氟乙酸(色譜純，美國Aldrich Chemical公司)；乙腈、甲醇等試劑(美國Fisher公司)；蛋白質定量試劑盒(美國GE公司)；α-烯醇化酶兔單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；絲切蛋白-1山羊多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；鼠抗β-actin單克隆抗體(杭州聯科生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 ICH組大鼠應用7%水合氯醛腹腔注射麻醉，生效后將大鼠俯臥位固定于立體定向儀上，消毒后頭部正中皮膚切開長約1 cm的縱切口，暴露前囟即Bregma點。中線右側旁開3 mm、向后1.2 mm，垂直進針6 mm，即為大鼠尾殼核區。調整立體定向儀，使其上的微量注射器尖端移至大鼠尾殼核區，用牙科鉆鉆孔，直徑約1 mm。用微量注射器抽取尾動脈血50μL，注入大鼠右側尾殼核區，注射時間約10 min、留針約10 min，緩慢退針后縫合頭部切口。術后大鼠恢復正常進食后，采用Longa評分法對大鼠行為學進行評分。正常對照組不予處理。在處理后72 h，處死2組動物，取血腫周邊腦組織和正常對照組的對應部位，用磷酸鹽緩沖液清洗后，凍存－80℃冰箱保存備用。

1.2.2 蛋白質組學分析

1.2.2.1 提取腦組織蛋白 稱重腦組織，通過細胞裂解液、勻漿、超聲、離心等方法提取得到腦組織蛋白的上清液，然后用蛋白質定量試劑盒測蛋白濃度[8]。

1.2.2.2 雙向電泳 主要參考Sultana等[9]和Wang等[10]的方法和Ettan IPGphor 3等電聚焦電泳系統操作指南進行。共做了18次ICH組與正常對照組獨立生物重復并行雙向凝膠電泳比較，通過Perseus軟件計算皮爾遜相關系數。然后將凝膠固定過夜、染色2～3 h、脫色液脫色，直至凝膠背景清晰為止。

掃描雙向電泳凝膠，以ImageMaster 2D Elite軟件進行圖像分析，得出代表蛋白含量的數值。用Perseus軟件(版本1.5.2.6)對所有批次實驗數據進行t檢驗，將表達量差異在2倍以上或0.5倍以下的蛋白點作為差異蛋白。

1.2.2.3 質譜鑒定肽段、蛋白以及生物數據庫檢索從凝膠上切下蛋白質點，處理成凝膠顆粒，然后對其進行脫色、脫水、酶解、抽提，并將多肽抽提液冷凍抽干。用4μL 0.1%三氟乙酸溶液溶解抽干的多肽，振蕩離心后，取2μL點于靶板上，用MALDI-TOF/ TOF質譜儀檢測，得到肽質量指紋圖譜。使用Mascot搜索引擎進行蛋白質鑒定(http://www.matrixscience.com)。檢索結果中得分在51分以上的蛋白被檢索軟件認為可信[11]。應用 Ingenuity Pathway Analysis軟件對差異蛋白進行功能、細胞定位及相互作用分析。

1.2.3 Western Blot法驗證絲切蛋白-1和α-烯醇化酶的表達含量 提取等量的ICH組血腫周邊腦組織和正常對照組大鼠相應部位的腦組織蛋白，分別做12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉至聚偏二氟乙烯膜，將轉好的膜放在含0.05%Tween-20的磷酸緩沖液配5%脫脂奶粉的封閉液10 mL中，室溫放置4 h或4℃過夜。分別加入一抗[絲切蛋白-1抗體(1∶500)、α-烯醇化酶抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶1 000)]和二抗孵育，然后顯影、定影、凝膠掃描。應用圖像分析軟件ImageJ對Western Blot法條帶進行分析，根據蛋白的含量作出柱狀圖。

1.2.4 生物功能分析 通過UniProt(http://www. uniprot.org)對結果進行分析，查找與整個蛋白組表達量變化最相關的通路。用Ingenuity Pathway Analysis軟件分析差異表達蛋白。

2 結果

2.1 動物模型評分 ICH組6只大鼠手術后約1.5 h，意識恢復，可以正常進食，且均出現不同程度的左側前爪不能伸展，行走時向左側轉圈，Longa評分法評分為2分。

2.2 雙向電泳顯示的蛋白質表達譜全貌 大鼠ICH組與正常對照組腦組織蛋白質的雙向凝膠電泳圖譜得到39種差異表達的蛋白。其中上調蛋白15種，H3、H4為同一種蛋白:血清白蛋白；H11和H13為同一種蛋白:神經膠質纖維酸性蛋白。下調蛋白24種，其中L4和L20為同一種蛋白:磷酸甘油酸變位酶-1(圖1)。39種蛋白的名稱、相對分子質量、亞細胞定位等見表1。通過Perseus軟件計算皮爾遜相關系數為0.93(圖2)。蛋白點L4經質譜鑒定為磷酸甘油酸變位酶-1，3D模擬圖見圖3。ICH組與正常對照組表達量差異為0.495，即在ICH組中表達下調。

圖1 大鼠腦組織蛋白質的雙向凝膠電泳圖譜

圖2 18次重復實驗結果的火山圖

圖3 磷酸甘油酸變位酶-1的3D模擬圖

2.3 Western Blot法驗證2種蛋白表達含量差異驗證絲切蛋白-1、α-烯醇化酶的Western Blot法得到柱狀圖，ICH組和正常對照組差異有統計學意義(P＜0.01，圖4)。

圖4 絲切蛋白-1和α-烯醇化酶的Western Blot法驗證

2.4 生物功能 ICH后72 h血腫周圍腦組織的蛋白質主要涉及細胞骨架蛋白、物質代謝以及抗氧化作用、細胞凋亡等相關功能。其中差異表達的22種蛋白在細胞中的定位及相互作用網絡圖見圖5。

表1 通過MALDI-TOF/TOFMS鑒定出的大鼠ICH組和正常對照組的差異蛋白

圖5 22種差異蛋白在細胞中的定位及相互作用

3 討論

ICH對腦組織的第二階段的損害是瀑布級聯反應式的，腦組織水腫、細胞凋亡、壞死以及炎癥細胞的釋放等都可能進一步加重腦組織的損害[12]。本研究發現ICH后72 h血腫周圍腦組織有一組差異表達蛋白，這些差異蛋白主要存在于細胞質中，它們功能體現集中在細胞骨架蛋白、能量代謝酶類、細胞凋亡、抗氧化蛋白、神經遞質代謝酶類等方面。討論重點分析細胞骨架蛋白。

細胞骨架主要由微管、微絲和中間纖維組成。微絲主要由肌動蛋白組成。肌動蛋白以球狀肌動蛋白和纖維狀肌動蛋白2種形式存在。肌動蛋白解聚因子/絲切蛋白家族都屬于肌動蛋白結合蛋白，主要作用是通過解聚和分離纖維狀肌動蛋白從而維持球狀肌動蛋白的重復利用。細胞骨架蛋白不僅與神經元形態密切相關，而且參與神經元的運動、軸漿運輸、信息傳遞及細胞分裂、分化、基因表達等多種功能。本研究發現4種細胞骨架蛋白表達量發生變化，其中成束蛋白、絲切蛋白-1和神經絲輕鏈多聚肽蛋白表達下降，神經膠質纖維酸性蛋白表達上調。絲切蛋白-1屬于肌動蛋白解聚因子/絲切蛋白家族，在腦組織表達。研究表明，ICH的氧化應激作用可能是絲切蛋白-1活化和氧化的主要機制，而絲切蛋白-1氧化可導致細胞凋亡[13]。在缺血和缺氧的原代小鼠的皮質神經元，Madineni等[14]應用絲切蛋白小干擾RNA使得絲切蛋白-1表達減少，發現減少了其到線粒體的移位和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3的活化，同時提高了神經元的生存能力。絲切蛋白還可以抑制凋亡前蛋白Bax從而阻止少突膠質前體細胞的凋亡。而在ICH的第二階段，谷氨酸鹽的興奮性毒性會阻礙絲切蛋白的這種抗凋亡作用，從而誘發了少突膠質前體細胞的凋亡[15]。此外，血腦屏障破壞的基本機制考慮與絲切蛋白的活化和緊密連接蛋白的重新分配有關[16]。大鼠腦梗死后4 h，缺血半暗帶區的大腦皮質中發現絲切蛋白是過表達的[17]。而本研究中，大鼠ICH后72 h，即ICH的第二階段，絲切蛋白-1表達下降，影響肌動蛋白的動力學，破壞細胞骨架，考慮進一步加重了細胞結構及功能的損害，推測絲切蛋白-1的修復可能會穩定細胞骨架結構，有利于腦功能的恢復及ICH的預后，有望成為ICH治療的靶點。我們將進一步對絲切蛋白進行深入研究。

成束蛋白是由成束基因(該基因定位于7p22，長約13.8 kb，包括5個外顯子和4個內含子)編碼的產物，相對分子質量55×103、能與F-肌動蛋白結合成平行的束狀結構的細胞骨架蛋白，含493個氨基酸，由4個β-折疊組成，其N端11～50之間的氨基酸殘基高度保守；其中，第39位的絲氨酸為蛋白激酶C的磷酸化位點，該位點的磷酸化可調節成束蛋白與F-肌動蛋白的結合活性以及細胞膜表面絲狀偽足和微棘，與細胞的運動、黏附及癌細胞的轉移有密切關系[18]。目前有關成束蛋白與腦血管病的研究很少。本研究中，發現成束蛋白表達下調，提示成束蛋白與ICH有一定關系，但具體機制仍需進一步的實驗和研究。

本研究發現，在大鼠ICH后72 h腦組織的一系列蛋白表達發生變化，提示在ICH后腦組織內細胞網絡間發生復雜的多種代謝通路的變化，其中以細胞骨架蛋白表達異常最為顯著，有望成為ICH治療的潛在靶點，為今后ICH治療提供理論基礎及研究方向。

致謝感謝北京大學紀建國教授提供蛋白質雙向電泳分離質譜鑒定平臺

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Quantitative proteom ic analysis of rat brain tissue at 72-hour after intracerebral hemorrhage

LIXiaofang1，2，YANGGuofeng2，LIU Li3，WANG Luning4
(1.Department of Neurology，Kailuan General Hospital，Tangshan Hebei 063000，China；2.Department of Neurology，the Second Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang Hebei 050000，China；3.Medical Center of Navy Aviator Enlistment，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；4.Department of Neurology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China)

ObjectiveTo identify the differentially expressed proteins in rat intracerebral hemorrhage(ICH)and analyze the related physiopathologic mechanism to pave the way for screening special function related proteins and drug targets.M ethodsWe made a rat ICH model and then used two-dimensional gel electrophoresis(2-DE)andmatrix-assisted laser desorption ionization-time of flight/time of flightmass spectrometry(MALDI-TOF/TOF MS)to identify the differentially expressed proteins between the 72-hour after ICH group and the normal control group，and then used Western Blot to validate.ResultsIn total，39 proteins differentially expressed were identified in 18 replicated experiments，among which 15 proteins are up-regulated and 24 proteinswere down-regulated.Then，2 key proteins were validated by Western Blot.These differentially expressed proteins include energymetabolic enzymes，antioxidants proteins，apoptosis related proteins cytoskeleton proteins and other proteins.ConclusionCytoskeleton proteins were closely related to pathogenesis of ICH.Thesemay provide the key information and theoretical clue for exploring the ICH physiopathologic process and would be potential therapeutic targets in ICH.

Intracerebral hemorrhage(ICH)；Proteomics；Mass spectrometry；Cytoskeleton proteins；Rat

R743.34-332；Q51

A

2095-3097(2017)02-0074-06

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.02.003

2016-09-28 本文編輯:徐海琴)

國家自然科學基金面上項目(31270872)

063000河北 唐山，開灤總醫院神經內科(李曉芳)；050000河北石家莊，河北醫科大學第二醫院神經內科(李曉芳，楊國鋒)；100048北京，海軍總醫院?？涨隗w檢中心(劉 麗)；100853北京，解放軍總醫院神經內科(王魯寧)

楊國鋒，E-mail:yang-guofeng＠163.com