大鼠成骨細胞微小RNAs的篩選研究

潘 欣，曾思良，梁興倫，嵇承棟，周文博，周文銳，李 琛，朱敏潔，沈 琪

·基礎研究·

大鼠成骨細胞微小RNAs的篩選研究

潘 欣，曾思良，梁興倫，嵇承棟，周文博，周文銳，李 琛，朱敏潔，沈 琪

目的 應用微小RNAs(microRNAs，miRNAs)芯片技術篩選補腎方含藥血清干預大鼠成骨細胞后差異表達的miRNAs，與前期獲得的軟骨細胞差異miRNAs比較，篩選出共有差異miRNAs，以探討補腎方通過共有miRNAs調控靶基因表達發揮治療效應的機制。方法 原代培養的大鼠成骨細胞經堿性磷酸酶染色、Ⅰ型膠原免疫熒光染色和礦化結節染色鑒定后，用補腎方含藥血清干預成骨細胞，在給定時間點收獲細胞，抽提純化總RNAs行miRNAs芯片檢測，并挑選差異表達4倍以上的miRNAs行實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應驗證。結果 所培養的原代細胞具有典型的成骨細胞形態和功能，堿性磷酸酶染色、Ⅰ型膠原免疫熒光染色和礦化結節染色均為陽性。與補腎方含藥血清干預成骨細胞1 d相比，干預6 d的共有229個2倍以上表達差異的miRNAs，其中上調的52個、下調的177個。差異表達4倍以上的miRNAs實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應結果與芯片數據一致。與前期軟骨細胞差異miRNAs芯片數據比較，miRNAs均上調2倍以上的有8個、下調4倍以上的2個。結論 補腎方含藥血清干預成骨細胞獲得了一套較為特異的miRNAs，初步預測上調的miRNAs可能通過靶向Runx2、Wnt、Notch、Axin2等基因在骨發育、骨形態發生、骨吸收以及軟骨內成骨形成等相關的信號通路中發揮作用。

補腎方；成骨細胞；微小RNAs芯片；差異表達；大鼠

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種進展性、長病程、世界性流行病。補腎填精法是中醫治療OP的基本治則[1]。目前各種用于治療OP的補腎中藥劑中均配制了富含植物性雌激素的中藥淫羊藿等，這些方劑及其有效成分在治療OP作用機制方面的研究已從多方面展開，調控骨形成和吸收重要的轉錄因子有Runx2/Cbfα1和Osx/SP7；在細胞分子信號通路水平研究較多的有Wnt/β-catenin信號轉導通路、Axin2/β-catenin信號轉導通路、β-catenin OPG信號轉導通路、FoxO1-Runx2信號通路、BMP-Smad-Runx2信號通路、JAK/STAT信號通路、Notch信號通路、RANK-OPG-RANKL信號通路、MAPK信號通路、TGF-β信號通路，以及這些通路激活后引起相關基因的表達、抑制，進而影響成骨細胞的骨形成與破骨細胞的骨吸收功能之間的再平衡等。這些研究對認識補腎方藥劑對OP病理變化的影響，以及如何對抗OP的這些變化、改善骨礦密度、重塑骨質量(骨微結構、骨轉換、骨礦化和骨微損傷等)提供了重要資料。然而，由于OP發病機制的復雜性，仍有許多重要問題尚待闡明。

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類小分子內源性單鏈非編碼RNAs(18～24個核苷酸)，它通過與靶信使RNAs 3′-端非翻譯區完全或不完全的互補結合，快速促進靶信使RNAs降解或抑制轉錄后基因的表達，進而在細胞演化、增殖、分化、癌變及凋亡等多種細胞進程中發揮重要作用[2]。目前已知[3]可觸發骨形成的功能性miRNAs主要有miR-196a、miR-210、miR-22、miR-309、miR-379、miR-764-5b、miR-2861、miR-29；抑制骨形成的功能性miRNAs主要有miR-125b、miR-206、miR-100、miR-138、miR-141、miR-637和miR-93。為進一步探討補腎方對成骨細胞的作用機制，本研究采用miRNAs芯片技術了解用補腎方含藥血清處理大鼠成骨細胞后miRNAs的表達變化，為OP治療中的補腎方干預策略提供miRNAs調控靶標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡雌性 Sprague-Dawley (SD)清潔級大鼠20只(第二軍醫大學動物實驗中心提供，SCXK(滬)2012-0003)，體重200～250 g，按嚙齒類動物標準飼料飼養于第二軍醫大學動物實驗中心清潔級鼠房，分籠飼養。

1.1.2 含藥血清制備 補腎方劑由熟地黃、菟絲子、牛膝、龜板膠、鹿角膠、山藥、山茱萸、枸杞子、淫羊藿和女貞子藥物組成，補腎方組中藥煎制與灌胃方法依本項目已建立的方法執行[4]。對照組以等劑量注射用0.9%NaCl溶液灌胃。補腎方含藥血清經0.2μm濾器過濾，置－80℃冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 大鼠成骨細胞培養 1～5日齡SD大鼠乳鼠20只(第二軍醫大學動物實驗中心提供，SCXK(滬) 2012-0003)，不計體重、不分雌雄，在A2級生物安全柜內用70%乙醇消毒皮膚表面，斷頭處死；無菌條件下分離取出顱蓋骨，用彎頭鑷子背面輕刮骨面去除軟組織和骨膜，用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)反復清洗后，將分離出的整個顱蓋骨浸入1 mL 0.25%胰酶中37℃消化30min，以去除顱蓋骨表面的組織細胞；用PBS清洗2次后，將顱蓋骨浸入1 mL 2mg/mL的Ⅰ型膠原酶中，剪碎成粉末狀，混勻，37℃消化2 h，期間手動搖勻以消化充分。1 500 r/ min離心10min使細胞沉淀，用PBS洗1次去除Ⅰ型膠原酶，以α-最低必需培養液培養重懸細胞，過100 μm細胞濾網去除骨碎片。將細胞懸液用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的α-最低必需培養液培養于含5%CO2飽和濕度的37℃的培養箱內。24 h后換液，以后每2 d換液1次。8 d后行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。

1.2.2 成骨細胞鑒定

1.2.2.1 堿性磷酸酶細胞化學染色 取24孔板培養的同批次原代細胞，培養10 d，用4%多聚甲醛室溫固定10min，蒸餾水清洗2次，用美國Vector Laboratories公司的VECTOR藍色堿性磷酸酶底物(blue alkaline phosphatase substrate)試劑盒染色，即在5 mL 100mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液中加80μL試劑1、80μL試劑2和45μL試劑3成為新鮮配制的染色液，每孔加入1mL混勻的染色液，37℃避光染色15 min。蒸餾水清洗5次，24孔板內保留少量水，鏡檢。

1.2.2.2 Ⅰ型膠原免疫熒光染色 將無菌蓋玻片置于6孔板內，接種同批次原代細胞，培養4 d制備成細胞爬片。PBS洗滌后用4%多聚甲醛室溫固定10min，PBS洗滌后用含0.5%Triton X-100的PBS透化30min。PBS洗后用美國Thermo公司的Image-iTTMFX信號增強劑封閉30 min。用PBS按1∶500稀釋Ⅰ型膠原兔抗大鼠一抗浸沒爬片，置4℃過夜，室溫復溫2 h后PBS洗滌。用PBS按1∶1 000稀釋鍵合了Alexa Fluor 594的羊抗兔二抗(美國Thermo公司)浸沒爬片，室溫孵育1 h，PBS洗滌干燥后，用含4’，6-二脒基-2-苯基吲哚的抗褪色金牌介質在載玻片上裝片，指甲油封片，鏡檢。

1.2.2.3 茜素紅鈣沉積染色 取24孔板培養的同批次原代細胞，培養21 d，95%乙醇室溫固定 10 min，蒸餾水清洗3次，每孔加入1 mL含1%茜素紅的0.05mol/L Tris-HCl(pH 4.2)染液染色3min，蒸餾水清洗5次，24孔板內保留少量水，鏡檢。

1.2.3 miRNAs芯片分析 成骨細胞分別用補腎方含藥血清(補腎方組)或0.9%NaCl溶液灌胃血清(對照組)干預，總RNAs抽提、質檢、芯片雜交與數據采集分析參照本項目已建立的方法執行[4]。

miRNAs表達的聚類分析采用每組芯片平均值歸一化后的數據，用Cluster 3.0軟件的非監督聚類分析方法將補腎方含藥血清處理成骨細胞1 d或6 d的樣本放在一起聚類分析。

1.2.4 miRNAs表達的驗證 從上調或下調4倍以上差異表達的miRNAs中各挑選1個應用實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)進行驗證(上調的選擇rno-miR-205，下調的選擇rno-miR-335)，U6小核RNAs設為內參基因，反應條件參照本項目已建立的方法執行[4]。rno-miR-205的上游引物為:5′-ACGA TCCTTCATTCCACCGG-3′，下游引物為:5′-GTGCA GGGTCCGAGGT-3′，逆轉錄引物為:5′-GTCGTATCC AGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACA CAGACT-3′。rno-miR-335的上游引物為:5′-ACGATC AAGAGCAATAACGA-3′，下游引物為:5′-GTGCAGGG TCCGAGGT-3′，逆轉錄引物為:5′-GTCGTATCCAGTG CAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACATT TT-3′。U6的上游引物為:5′-GCTTCGGCAGCACATA TACTAAAAT-3′，下游引物為:5′-CGCTTCACGAATT TGCGTGTCAT-3′，逆轉錄引物為:5′-CGCTTCACGAA TTTGCGTGTCAT-3′。

根據miRNAs芯片分析結果，分別用rno-miR-205和rno-miR-335的逆轉錄引物和上、下游引物檢測2種miRNAs在補腎方或0.9%NaCl溶液灌胃血清處理成骨細胞1 d或6 d總RNAs樣品中的轉錄表達情況。

1.3 統計學處理 應用SAS 4.0軟件，計量資料以均值±標準差(ˉx±s)表示，2組比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

圖1 大鼠原代成骨細胞性狀鑒定

2.1 大鼠原代成骨細胞性狀鑒定 大鼠成骨細胞24 h貼壁后呈多形性，有較多突起(圖1A)。HE染色顯示細胞核內有1～2個核仁(圖1B)。堿性磷酸酶染色可見細胞呈現深藍色(圖1C)；Ⅰ型膠原免疫熒光法染色可見胞質中呈現紅色，為強陽性反應(圖1D)；茜素紅染色可見胞內沉積鈣與茜素紅反應，得到紅染陽性結果，可見礦化結節形成(圖1E)。

2.2 miRNAs芯片分析 補腎方含藥血清或0.9% NaCl溶液灌胃血清處理成骨細胞1 d和6 d的miRNAs分別雜交3張芯片，圖2A顯示補腎方含藥血清處理成骨細胞1 d的3張芯片(藍色實心點)之間重復樣本數據的均一性較好，與補腎方含藥血清處理成骨細胞6 d(紅色實心點、均一性好)芯片數據之間差異較大。而0.9%NaCl溶液灌胃血清處理成骨細胞1 d的3張芯片(藍色空心點、均一性好)與處理6 d (紅色空心點、均一性好)之間差異較小。

補腎方含藥血清處理成骨細胞1 d和6 d兩樣本間的相關性分析見圖2B，相關系數r為0.986 1 (P＜0.000 1)，距離X＝Y這條直線較遠的散點較多，分散程度大。0.9%NaCl溶液灌胃血清處理成骨細胞1 d和6 d兩樣本間的相關性分析見圖2C，相關系數r為0.971 6(P＜0.000 1)，距離X＝Y這條直線較遠的散點較少，分散程度小。

圖2 含藥血清處理成骨細胞miRNAs表達譜數據分析

聚類分析得到存在差異性表達的miRNAs見圖3。

圖3 miRNAs芯片數據的聚類分析

根據上調或下調2倍以上、P＜0.05的標準，得到52個上調miRNAs(rno-miR-1224、rno-miR-124-1、rno-miR-124-2、rno-miR-124-3、rno-miR-133c、rno-miR-150、rno-miR-181c-5p、rno-miR-183-3p、rno-miR-195-3p、rno-miR-195-5p、rno-miR-200b-3p、rno-miR-204-3p、rnomiR-205、rno-miR-223-3p、rno-miR-224-3p、rno-miR-291a-3p、rno-miR-297、rno-miR-3065-3p、rno-miR-3085、rno-miR-323-5p、rno-miR-328a、rno-miR-338-5p、rno-miR-339、rnomiR-343、rno-miR-347、rno-miR-3473、rno-miR-351-3p、rno-miR-3569、rno-miR-3573-3p、rno-miR-3574、rno-miR-3584-5p、rno-miR-365-5p、rno-miR-378a-3p、rno-miR-378a-5p、rno-miR-378b、rno-miR-465-5p、rno-miR-466d、rnomiR-490-5p、rno-miR-497-5p、rno-miR-544、rno-miR-6215、rno-miR-6315、rno-miR-6318、rno-miR-6328、rno-miR-6332、rno-miR-6334、rno-miR-652-5p、rnomiR-665、rno-miR-678、rno-miR-760-5p、rno-miR-874-3p、rno-miR-92a-2)和177個下調miRNAs，其中上調4倍以上的有7個(表1)、下調4倍以上的有67個(表2)。

表1 大鼠miRNAs芯片表達上調4倍以上的miRNAs

2.3 定量RT-PCR驗證 將補腎方組數據與對照組相應數據比較后，圖4示rno-miR-205在補腎方含藥血清處理成骨細胞6 d中的轉錄表達是1 d的11.03倍(t＝12.90，P＝0.001)；rno-miR-335在補腎方含藥血清處理成骨細胞6 d中的轉錄表達是1 d的0.028倍(t＝370.3，P＜0.000 1)，與miRNAs芯片差異變化趨勢基本吻合。

表2 大鼠miRNAs芯片表達下調4倍以上的miRNAs

圖4 定量RT-PCR驗證補腎方含藥血清處理成骨細胞miRNAs的差異表達

3 討論

中醫藥學在防治OP方面歷史悠久，同時對OP伴發的慢性疼痛、心悸失眠、抑郁、不良情緒、新陳代謝紊亂等一系列臨床綜合征的治療均有一定療效。補腎填精法是中醫治療OP的基本治則。在中醫“川腎藏精，主骨生髓”理論指導下，根據“血瘀”“腎虛”證候，上海同濟大學附屬楊浦醫院老年科在原有專利藥“治療老年OP的純中藥配方及其免煎顆粒劑”[5]基礎上采用熟地黃、菟絲子、牛膝、龜板膠、鹿角膠、山藥、山茱萸、枸杞子、淫羊藿和女貞子10味藥配伍研制成補腎方中藥湯劑在改善中老年OP方面取得了較好的療效。為進一步探討補腎方對OP治療的作用機制，本研究用補腎方含藥血清干預原代培養的成骨細胞，通過miRNAs芯片分析篩選出差異表達的miRNAs，以期通過預測miRNAs作用的靶基因及其參與的信號通路調節來理解補腎方通過miRNAs調控靶基因的表達進而發揮治病效應。

成骨細胞來源于骨髓間充質干細胞，是骨形成細胞，成熟的成骨細胞會合成分泌大量Ⅰ型膠原、非膠原蛋白、酶和生長因子等骨基質主要成分，骨基質隨后逐漸礦化[6]。體外成骨細胞對骨組織的生長發育、骨代謝平衡、骨量平衡和損傷修復起關鍵作用，是骨組織中機械應力的主要效應細胞[7]。本研究在不剪碎乳鼠顱蓋骨的情況下，先用胰酶消化去除骨表面纖維組織及骨髓組織，再于Ⅰ型膠原酶消化液中剪碎消化，簡潔快速地獲得了大量成骨細胞。通過堿性磷酸酶染色、Ⅰ型膠原免疫染色和鈣結節形成實驗對獲得的原代細胞進行了成骨細胞特性的陽性鑒定。本研究用補腎方或注射用0.9%NaCl溶液以臨床等效劑量給予8周齡雌性大鼠灌胃，制備含藥大鼠血清，進而用以干預成骨細胞。圖2A提示實驗設計較為合理，圖2B提示補腎方組兩樣本間mi-RNAs表達差異數量較多，而圖2C提示對照組兩樣本間miRNAs表達差異數量較少。抽提干預后成骨細胞總RNAs，經miRNAs芯片篩選，獲得2倍以上表達變化的miRNAs共計229個，其中上調的52個、下調的177個。分別從上調或下調4倍以上的miRNAs中各選1個行實時熒光定量RT-PCR驗證，提示芯片數據結果可信。

本研究中的miRNAs芯片中52個2倍以上上調表達，這些上調表達的miRNAs與引言中提到的可觸發骨形成的miRNAs不同，可能是本研究所用補腎方所特別激發的。通過搜索已知miRNAs靶基因數據庫發現，其中 rno-miR-205、rno-miR-3584-5p可靶向Runx2(成骨細胞的特異轉錄因子[8])；rno-miR-195-5p、rno-miR-221-5p、rno-miR-328a-5p、rno-miR-378a-3p、rno-miR-497-5p和 rno-miR-3584-5p可靶向 Wnt (可抑制間充質干細胞向脂肪細胞分化、增加堿性磷酸酶表達、促進成骨形成[9])；rno-miR-497-5p可靶向Axin2(骨形成負向調節因子[10])；rno-miR-221-5p可靶向Notch(負向調節成骨分化[11])。由于1種miRNAs可以調控多種基因，1條基因也可以受多種miRNAs的調控，目前預測的miRNAs靶向基因可能發揮的作用還需要進一步實驗以驗證靶基因的表達情況，闡明miRNAs調控的具體方式。

將成骨細胞與軟骨細胞miRNAs差異表達芯片相比較，可見rno-miR-195-5p是2類芯片中均呈現4倍以上上調的miRNAs，rno-miR-133a-3p和rno-miR-206-3p是均呈現4倍以上下調的miRNAs。此外，rnomiR-181c-5p、rno-miR-347、rno-miR-3569、rno-miR-3584-5p、rno-miR-378b、rno-miR-465-5p、rno-miR-6315均呈現2倍以上上調的miRNAs。

rno-miR-195-5p可靶向細胞周期蛋白依賴激酶8[12]、細胞周期素3[13]、血管內皮細胞生長因子[14]，其過表達可表現其抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移的抑癌功能和降低微血管密度的作用，骨形態形成蛋白2也是其靶基因之一[15]。rno-miR-195-5p是否還可以靶向其他與骨形成相關的靶基因，以及它在調控骨形成中的作用，還有待進一步探索。

下一步工作將對這些具有表達共性的miRNAs逐一開展其正負向干預對靶基因表達的影響研究，以驗證補腎方通過干預miRNAs調節靶基因表達發揮治療效應的可能性。

[1]Tang DZ，Hou W，Zhou Q，et al.Osthole stimulates osteoblast differentiation and bone formation by activation of beta-catenin-BMP signaling[J].JBone Miner Res，2010，25(6):1234-1245.

[2]Park JH，Shin C.MicroRNA-directed cleavage of targets: mechanism and experimental approaches[J].BMB Rep，2014，47(8):417-423.

[3]Zhao X，Xu D，Li Y，et al.MicroRNAs regulate bone metabolism[J].JBone Miner Metab，2014，32(3):221-231.

[4]潘欣，梁興倫，曾思良，等.補腎方含藥血清干預大鼠椎間盤軟骨細胞miRNA的差異表達[J].上海中醫藥雜志，2016，50(1):71-76.

[5]梁興倫.治療老年骨質疏松癥的純中藥配方及其免煎顆粒劑[P].ZL201010103204X.http://epub.sipo.gov.cn/ gjcx.jsp.

[6]Zhao H.Membrane trafficking in osteoblasts and osteoclasts:new avenues for understanding and treating skeletal diseases[J].Traffic，2012，13(10):1307-1314.

[7]Lama A，Santoro A，Corrado B，et al.Extracorporeal shock waves alone or combined with raloxifene promote bone formation and suppress resorption in ovariectomized rats[J]. PLoSOne，2017，12(2):e0171276.

[8]Lim KE，Park NR，Che X，et al.Core binding factorβof osteoblastsmaintains corticalbonemass via stabilization of Runx2 in mice[J].J Bone Miner Res，2015，30(10): 1943.

[9]Jiang T，Zhou B，Huang L，et al.Andrographolide exerts pro-osteogenic effect by activation of Wnt/β-catenin signaling pathway in vitro[J].Cell Physiol Biochem，2015，6 (6):2327-2339.

[10]McGee-Lawrence ME，Li X，Bledsoe KL，et al.Runx2 protein represses Axin2 expression in osteoblasts and is required for craniosynostosis in Axin2-deficientmice[J].J Biol Chem，2013，88(8):5291-5302.

[11]Yang GC，Xu YH，Chen HX，et al.Acute lymphoblastic leukemia cells inhibit the differentiation of bone mesenchymal stem cells into osteoblasts in vitro by activating Notch signaling[J].Stem Cells Int，2015，2015:162410.

[12]Luo Q，Zhang Z，Dai Z，et al.Tumor-suppressive micro RNA-195-5p regulates cell growth and inhibits cell cycle by targeting cyclin dependent kinase 8 in colon cancer [J].Am JTransl Res，2016，8(5):2088-2096.

[13]Zhang QQ，Xu H，Huang MB，et al.MicroRNA-195 plays a tumor-suppressor role in human glioblastoma cells by targeting signaling pathways involved in cellular proliferation and invasion[J].Neuro Oncol，2012，14(3):278-287.

[14]Sandrim VC，Dias MC，Bovolato AL，et al.Plasma from pre-eclamptic patients induces the expression of the antiangiogenicmiR-195-5p in endothelial cells[J].JCell Mol Med，2016，20(6):1198-1200.

[15]Grünhagen J，Bhushan R，Degenkolbe E，et al.MiR-497～195 cluster microRNAs regulate osteoblast differentiation by targeting BMP signaling[J].JBone Miner Res，2015，30(5):796-808.

Identification of differentially expressed m iRNAs in rat osteoblasts

PAN Xin1，ZENG Siliang2，LIANG Xinglun3，JIChengdong4，ZHOUWenbo5，ZHOUWenrui3，LIChen3，ZHU Minjie3，SHEN Qi3
(1.Central Laboratory，Yangpu Hospital，School of Medicine，Tongji University，Shanghai200090，China；2.Department of Rehabilitation Therapy，Tianhua College，Shanghai Normal University，Shanghai 201815，China；3.Department of Geriatrics，Yangpu Hospital，School of Medicine，Tongji University，Shanghai 200090，China；4.Department of Scientific Research Management，Yangpu Hospital，School of Medicine，Tongji University，Shanghai200090，China；5.Department of General Surgery，Yangpu Hospital，School of Medicine，Tongji University，Shanghai200090，China)

ObjectiveThe purpose of this study is to identify the microRNAs(miRNAs) differential expression profile related to sensitivity for Bushen decoction-medicated serum of ratosteoblast cells bymiRNAs array technique，and screen a set of commonmiRNAs to compare with ealier miRNAs array data of rat intervertebral disc chondrocytes for further study their regulation target genesmechanism.M ethodsThe primary rat osteoblasts were identified by alkaline phosphatase staining，collagen typeⅠimmunofluorescent staining and mineralized nodules staining.The osteoblastswere cultured in serum containing Bushen decoction or normal saline.The total RNAs were isolated and purified and recruited formiRNAs array analysis.The selected putative regulated miRNAs were validated by real-time fluorescent quantitation reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsThe twice-enzyme digestion method was practicable to obtain a large number of purified primary rat osteoblastswith typical osteoblasts characteristics.Alkaline phosphatase stai-ning and collagen typeⅠimmunofluorescent staining andmineralized nodules stainingwere positive. By significance analysis ofmicroarrays(SAM)based on microarray screening，229 different expression ofmiRNAs(52 up-regulated and 177 down-regulated more than twice)were found in serum cultured 6 d.Quantitative RT-PCR further validated that the expression levels of rno-miR-205 over 4-fold up-regulated and rno-miR-335 over 4-fold down-regulated significantly in the cultured 6 d compared to the cultured 1 d.There were 8 common miRNAs up-regulated more than twice both in miRNAs array data of rat osteoblast cells and intervertebral disc chondrocytes and 2 commonmiRNAs down-regulated more than 4-fold.ConclusionA set of specific miRNAs obtained after Bushen decoction containing serum intervention on rat osteoblast cells.Target gene prediction software predict the up-regulated miRNAs mainly by regulating bone development，bone morphogenesis，bone resorption and endochondral bone morphogenesis through the target genes，such as Runx2，Wnt，Notch，and Axin2，et al.

Bushen decoction；Osteoblast；MicroRNAs array；Differential expression；Rat

R342.2；R349.5-332

A

2095-3097(2017)02-0068-06

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.02.002

2017-01-21 本文編輯:徐海琴)

國家重點基礎研究發展計劃(2013CB531601)；國家自然科學基金面上項目(30972633，81173312)；上海市衛生和計劃生育委員會科研項目(201640253)；同濟大學附屬楊浦醫院學科帶頭人攀登計劃(YE2201608)

200090上海，同濟大學附屬楊浦醫院中心實驗室(潘 欣)；201815上海，上海師范大學天華學院康復治療系(曾思良)；200090上海，同濟大學附屬楊浦醫院老年科(梁興倫，周文銳，李 琛，朱敏潔，沈 琪)，科研部(嵇承棟)，普外科(周文博)

潘 欣，E-mail:xinpanpx＠163.com；梁興倫，E-mail:liangxinglun＠sina.com