基于design-expert軟件設(shè)計(jì)優(yōu)化動(dòng)物雙歧桿菌培養(yǎng)條件工藝

林秀芳，尹文哲，張智,*，馬建章，李杰

（1.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150086；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030）

基于design-expert軟件設(shè)計(jì)優(yōu)化動(dòng)物雙歧桿菌培養(yǎng)條件工藝

林秀芳1，尹文哲2，張智1,*，馬建章1，李杰3

（1.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150086；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030）

主要研究培養(yǎng)條件對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌活菌數(shù)的影響，design-expert軟件輔助優(yōu)化設(shè)計(jì)，以期更好的為雙歧桿菌的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)需要。采用改良的玉米糖化液為培養(yǎng)基，以活菌數(shù)為響應(yīng)值，選取不同的玉米糖化液濃度、培養(yǎng)溫度、接種量和初始pH，借助design-expert軟件建立四因素三水平的試驗(yàn)，得到響應(yīng)值與各因素之間交互作用的數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明：接種量與培養(yǎng)溫度一次項(xiàng)顯著，4個(gè)因素的二次項(xiàng)及玉米糖化液濃度與接種量的交互項(xiàng)顯著，其他項(xiàng)不顯著。動(dòng)物雙歧桿菌的最佳培養(yǎng)條件分別為：接種量7.4%，玉米糖化液濃度12.0°Bx，初始pH 6.5，培養(yǎng)溫度37.4℃。

動(dòng)物雙歧桿菌；design-expert軟件；響應(yīng)面法；培養(yǎng)條件

動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobceterium animalis）是人體有益菌之一[1]。它可以對(duì)宿主發(fā)揮一定的作用，如免疫[2]、調(diào)節(jié)腸道菌群[3]、抗腫瘤[4]等。有研究表明[5]，經(jīng)動(dòng)物雙歧桿菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素有很好的食品加工特性[6]，有作為天然食品防腐劑的巨大發(fā)展?jié)摿7]。design-ex－pert軟件用于探究響應(yīng)面優(yōu)化條件，通過(guò)數(shù)學(xué)模型得出響應(yīng)面的最優(yōu)條件。本試驗(yàn)主要探究玉米糖化液濃度、接種量、pH值和溫度對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌活菌數(shù)的影響。采用低成本的玉米粉作為原料，制備玉米糖化液作為培養(yǎng)基，進(jìn)一步探究動(dòng)物雙歧桿菌的培養(yǎng)條件，以期能夠更好實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要原料與儀器

1.1.1 主要原料

動(dòng)物雙歧桿菌菌株：東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要儀器

YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密儀器科技有限公司；YXQG02手提式壓力蒸汽滅菌器：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣科技有限公司；XSZ-G顯微鏡：重慶光學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化

將保藏于斜面的菌株在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48 h至出現(xiàn)明顯菌落。觀(guān)察菌落的形態(tài)特征并挑取完整的菌落，隨后采用革蘭氏染色法染色并在顯微鏡下觀(guān)察，對(duì)疑為雙歧桿菌的菌落，用接種環(huán)挑取形態(tài)飽滿(mǎn)的菌落接種于改良玉米糖化液培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，置于冰箱備用。取一定量的菌液于改良的玉米糖化液培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，即為活化的菌種。選擇平板稀釋法分離菌株得到目標(biāo)菌株[8]。

1.2.2 動(dòng)物雙歧桿菌培養(yǎng)條件的確定

保證其他試驗(yàn)條件不變，分別變化不同濃度玉米糖化液濃度（6、8、10、12、14、16°Bx）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%、11%），初始pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）和培養(yǎng)溫度（31、33、35、37、39、41℃）進(jìn)行單因素試驗(yàn)[9]。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化雙歧桿菌培養(yǎng)條件

在探究單因素玉米糖化液、接種量、初始pH值和培養(yǎng)溫度單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定優(yōu)化試驗(yàn)的條件與水平。根據(jù)中心響應(yīng)面試驗(yàn)原則建立四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，采用design-expert軟件優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 動(dòng)物雙歧桿菌培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 玉米糖化液濃度對(duì)雙歧桿菌的影響

玉米糖化液濃度對(duì)雙歧桿菌的影響見(jiàn)圖1。

圖1 玉米糖化液對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effectof the corn juice concentration on cellgroWth

由圖1表明，8°Bx～12°Bx之間，隨著玉米糖化液濃度的增加，雙歧桿菌的活菌數(shù)也逐漸增加，12°Bx～16°Bx之間，隨著玉米糖化液的濃度的增加，活菌數(shù)降低。12°Bx為最佳糖化濃度。這可能由于，高濃度造成滲析現(xiàn)象，高滲溶液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有很大的影響。

2.1.2 接種量對(duì)雙歧桿菌的影響

接種量對(duì)雙歧桿菌的影響見(jiàn)圖2。

圖2 接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effectof Bifidobacterium inoculum on cellgroWth

由圖2表明，接種量為1%～7%，隨著接種量的增加，活菌數(shù)增加。接種量為7%～11%時(shí)，活菌數(shù)減少。7%為最佳接種量。這可能由于接種量越大，會(huì)造成菌株的抑制生長(zhǎng)，帶入更多的代謝物產(chǎn)生，使最終的代謝物較多，最終造成成本浪費(fèi)。

2.1.3 初始pH值對(duì)雙歧桿菌的影響

初始pH值對(duì)雙歧桿菌的影響見(jiàn)圖3。

圖3 初始pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effectof pH on cellgroWth

由圖3表明，初始pH值對(duì)雙歧桿菌的影響較大，隨著初始pH值的變化，動(dòng)物雙歧桿菌活菌數(shù)先增加后降低。初始pH值增加或降低都將影響細(xì)胞形態(tài)，pH值過(guò)高或過(guò)低動(dòng)物雙歧桿菌都無(wú)法正常生長(zhǎng)，故一般接近中性時(shí)，才能最好的保持細(xì)胞形態(tài)。動(dòng)物雙歧桿菌生長(zhǎng)的最佳pH值為6.5。

2.1.4 培養(yǎng)溫度對(duì)雙歧桿菌的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)雙歧桿菌的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，整體呈先增加再降低的趨勢(shì)。37℃為最佳溫度。在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度升高有利于微生物的代謝，但升高至某一溫度時(shí)，由于溫度的增加，細(xì)胞功能下降至死亡。溫度過(guò)高時(shí)，酶反應(yīng)失活，引起代謝失衡。溫度過(guò)低，抑制酶活性，降低了代謝活動(dòng)，從而抑制了雙歧桿菌的生長(zhǎng)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化雙歧桿菌菌株培養(yǎng)條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了玉米糖化液濃度、初始pH值、接種量和培養(yǎng)溫度的四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，其因素水平見(jiàn)表1和表2，所得試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平Table1 Variablesand levels in theexperim entaldesign

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table2 Experim ent resultsof response surfacem ethod

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Continue table2 Experiment resu ltsof responsesurfacemethod

表3 多元回歸模型方差分析表Table3 ANOVA for responsesurfacequadraticmethod

采用中心組合模型，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，總共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中包括5個(gè)中心點(diǎn)。分析后得到動(dòng)物雙歧桿菌的回歸方程y=4.11-0.018A+ 0.14B-0.004C+0.079D-0.28A2-0.35B2-0.4C2-0.26D2+ 0.15AB-0.018AC-0.05AD+0.022BC+0.000 35BD+ 0.053CD。公式中y為響應(yīng)值，A、B、C、D分別為玉米糖化液濃度、接種量、初始pH值和培養(yǎng)溫度對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值。動(dòng)物雙歧桿菌所建立的模型的不同處理組間變異極顯著（P＜0.01），說(shuō)明其應(yīng)變量與所有自變量之間線(xiàn)性關(guān)系是顯著的，即試驗(yàn)方法可靠，方程合理。A2、B2、C2與D2項(xiàng)差異顯著（P＜0.01）；玉米糖化液濃度與接種量的二次項(xiàng)差異顯著（P＜0.05）。通過(guò)F值還能看出，試驗(yàn)中各因素對(duì)活菌數(shù)變化的影響大小順序?yàn)椋航臃N量＞培養(yǎng)溫度＞玉米糖化液＞初始pH值。失擬項(xiàng)P= 0.442 1（P＞0.01）說(shuō)明失擬項(xiàng)對(duì)于純誤差而言是不顯著的，這證明此數(shù)學(xué)回歸模型建立的可靠。

圖5 接種量與玉米糖化液濃度對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌活菌數(shù)的影響Fig.5 Effectof Bifidobacterium inoculum and the corn juice concentration on cellgroWth

圖6 pH值與玉米糖化液濃度對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌活菌數(shù)的影響Fig.6 Effectof pH and the corn juice concentration on cellgroWth

由圖5～圖10所示，兩個(gè)因素之間交互影響基本呈由一個(gè)極大值點(diǎn)的拋物線(xiàn)型關(guān)系，都是先增加后減小的變化趨勢(shì)。兩個(gè)因素交互作用不顯著則等高線(xiàn)呈圓形，相反若顯著則呈橢圓或馬鞍形，等高線(xiàn)均呈現(xiàn)橢圓形，說(shuō)明試驗(yàn)中所有因素之間存在差異顯著[10]。最佳培養(yǎng)條件為：接種量7.41%，玉米糖化液濃度12.01°Bx，初始pH 6.48，培養(yǎng)溫度37.37℃，此條件下活菌數(shù)為4.13×109cfu/mL。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法優(yōu)化雙歧桿菌的培養(yǎng)條件的可靠性，對(duì)優(yōu)化后培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，參考實(shí)際操作，將優(yōu)化后培養(yǎng)條件調(diào)整為：接種量7.4%，玉米糖化液濃度12.0°Bx，初始pH 6.5，培養(yǎng)溫度37.4℃，此條件下活菌數(shù)為4.13×109cfu/mL。與模型預(yù)測(cè)值的相接近。

圖7 溫度與玉米糖化液濃度對(duì)活菌數(shù)的影響Fig.7 Effectof temperatureand the corn juice concentration on cellgroWth

圖8 pH值與接種量對(duì)活菌數(shù)的影響Fig.8 Effectof pH and Bifidobacterium inoculum on cellgroWth

圖9 接種量與溫度對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌活菌數(shù)的影響Fig.9 Effectof temperatureand Bifidobacterium inoculum on cell groWth

圖10 pH值與溫度對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌活菌數(shù)的影響Fig.10 Theeffectof tem peratureand pH on cellgroWth

3 結(jié)論

雙歧桿菌對(duì)于人體健康起著重要的作用，具有多種生理功能，提高免疫力、抗氧化、降低膽固醇等功效。雙歧桿菌可以應(yīng)用于醫(yī)藥及食品等行業(yè)。由于其厭氧特性的限制，所以對(duì)于如何提高雙歧桿菌活菌數(shù)的研究越來(lái)越多。本試驗(yàn)主要探究經(jīng)改良的玉米糖化液培養(yǎng)基優(yōu)化動(dòng)物雙歧桿菌培養(yǎng)條件的工藝。通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)BBD響應(yīng)面試驗(yàn)原理，進(jìn)一步確定響應(yīng)面的水平。優(yōu)化試驗(yàn)條件得到：接種量7.4%，玉米糖化液濃度12.0°Bx，初始pH 6.50，培養(yǎng)溫度37.4℃，此條件下活菌數(shù)為4.13×109cfu/mL。

[1]呂錫斌,何臘平,張汝嬌,等.雙歧桿菌生理功能研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2013(16)：353-358

[2]谷超,王志銳,魏駿飛,等.雙歧桿菌細(xì)胞壁組分免疫調(diào)節(jié)作用的研究[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004(2)：179-181

[3]伍靜,蘇春萍,王顯超,等.乳酸菌和雙歧桿菌制劑對(duì)小鼠腸道菌群失調(diào)模型的調(diào)節(jié)作用[J].科學(xué)技術(shù)與工程,2013(16)：4497-4500

[4]朱輝,張德純.雙歧桿菌抗腫瘤機(jī)制的研究現(xiàn)狀與展望[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2011(8)：764-767

[5]COLLADOM C,HERNANDEZM,SANZY.Production of bacteriocin-like inhibitory compounds by human fecal Bifidobacterium strains[J].Journalof Food Protection,2005,68(5)：1034-1040

[6]劉國(guó)榮,張郡瑩,王成濤,等.響應(yīng)面法優(yōu)化雙歧桿菌B04代謝產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件[J].食品科學(xué),2013(3)：147-152

[7]Liu Guorong,Song Zhenqin,Yang Xuelian.Antibacterialmechanism of bifidocin A,a novel broad-spectrum bacteriocin produced byBifidobacteriumfianimalis BB04[J].FOOD CO ROL,2016(62)：309-316

[8]張媛媛,趙敏,張寧.復(fù)合益生菌芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基及條件的優(yōu)化[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012(3)：93-97

[9]張智,黃放,王闖,等.青春雙歧桿菌耐氧馴化及培養(yǎng)條件的響應(yīng)面法優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2011(4)：208-212

[10]徐勇,余世袁,江華,等.培養(yǎng)條件對(duì)低聚木糖增殖青春雙歧桿菌的影響[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2001(3)：34-38

Optim ization of Fermentation Conditions for Bifidobacrium animalis Production on Design-Expert

LINXiu-fang1，YINWen-zhe2，ZHANG Zhi1，*，MA Jian-zhang1，LIJie3
（1.NortheastForestry University，Harbin 150040，Heilongjiang，China；2.Second Affiliated Hospitalof Harbin MedicalUniversity，Harbin 150086，Heilongjiang，China3.NortheastAgriculturalUniversity，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

The researchmainly explored optimization of fermentation conditions for Bifidobacterium animalis by response surfacemethodology，based on design-expertsoftware design，in order to provide the basis data for the further research andmeet the factory need.Meanwhile，the contactof Bifidobacterium animalis，corn juice concentration，pH and fermentation temperaturewere investigated on viable count.Themathematicalmodelof four factorsand three levelswas created according to design-expertsoftware design and Box-Behnken experimental design.The result showed that the interaction term of the contactof Bifidobacterium animalis and fermentation temperature and individualquadratic interaction term are significant，butothersare unsignificant.The optimum culture conditionswere obtained：7.4%of the Bifidobceterium animalis，12.0°Bx of the corn juice concentration，pH 6.5，fermentation temperatureof37.4℃.

Bifidobacrium animalis；design-expert；responsesurfacemethodology；fermentation condition

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.032

2016-12-28

大熊貓國(guó)際資金項(xiàng)目（SG1409）；黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（GA15B203）

林秀芳（1991—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：益生菌發(fā)酵。

*通信作者：張智（1964—），女（漢），教授，博士，研究方向：微生物與發(fā)酵工程。