基于旋轉設計優化膠原蛋白ACE抑制肽制備工藝

于志鵬，張霜，趙文竹，*，張倩，沈俊彤，王瑜，霍倩倩，勵建榮，*，劉靜波

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.吉林大學營養與功能食品研究室，吉林長春130062）

基于旋轉設計優化膠原蛋白ACE抑制肽制備工藝

于志鵬1，張霜1，趙文竹1，*，張倩1，沈俊彤1，王瑜1，霍倩倩1，勵建榮1，*，劉靜波2

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.吉林大學營養與功能食品研究室，吉林長春130062）

采用ProtamexR蛋白酶水解魚膠原蛋白源制備血管緊張素轉化酶（ACE）抑制肽，并采用pH-stat法測定水解度，對影響水解效果的pH值、溫度、底物濃度和加酶量4個因素進行考察，并進行三元二次通用旋轉設計進行優化，對活性肽的ACE抑制活性和結構進行分析。結果表明在底物濃度11.8%，pH 8.7，加酶量5.4%和酶解溫度53.6℃條件下，酶解1h所得的魚皮膠原蛋白水解度為16.6%，經高效液相測定魚皮ACE抑制活性為45%，經圓二色譜分析魚膠原蛋白ACE抑制肽主要以無規卷曲形式存在。

魚膠原蛋白；血管緊張素轉化酶；活性肽；二級結構

血管緊張素轉化酶（Angiotensin-converting Enzyme，ACE）對血壓具有重要的調節作用[1]，一方面它催化無活性的血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）轉化成具有升高血壓作用的血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）；另一方面能夠使具有降壓作用的舒緩激肽失活[2-3]。來源于食物蛋白的ACE抑制肽通過調節ACE活性從而起到降血壓作用，同時可最大限度避免降血壓藥物產生毒副作用，因此也越來越受到廣泛關注。近年來，大量降壓肽/ ACE抑制肽陸續在海洋生物中發現[4-5]，如金槍魚、鰹魚、蝦類、藻類等。魚皮作為加工中的下腳料，其中的膠原蛋白資源被大大浪費。本研究以魚皮膠原蛋白為原料制備ACE抑制肽，通過單因素試驗結合三元二次正交組合設計對魚皮膠原蛋白制備ACE抑制肽的工藝條件進行優化，旨在拓寬ACE活性肽的原料來源并提高水產加工的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚膠原蛋白：河北百味生物科技有限公司；血管緊張素轉化酶（ACE）、卡托普利、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）、馬尿酸：美國Sigma公司；ProtamexR蛋白酶（活力1.5 AU-N/g）：諾維信公司；乙腈、甲醇、三氟乙酸（色譜純）：美國Thermo Fisher科技公司。

高效液相色譜儀：美國安捷倫科技公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋：金壇大地自動化儀器廠；ZD-2雷磁電位滴定儀：上海雷磁儀器廠；JJ-1精密增力電動攪拌器：江蘇省金壇市自動化儀器廠；AG204型電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；RE 52-86A旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；KQ-100DB臺式數控超聲波清洗器：成都一科儀器設備有限公司；IR Prestige-21傅里葉紅外光譜：島津企業管理（中國）有限公司；Jasco J-810圓二色譜儀：日本分光（JASCO）株式會社。

1.2 方法

1.2.1 魚膠原蛋白源的酶解工藝

取一定量魚膠原蛋白加蒸餾水并加熱使其溶解制成相應質量濃度的膠原蛋白溶液。利用ProtamexR蛋白酶對魚膠原蛋白進行水解，水解時置于水浴鍋中并用電動攪拌器不斷攪拌，到達設定反應時間后，提高溫度至90℃終止水解反應。酶解液經冷凍離心取上清液進行后續試驗。

1.2.2 單因素試驗

以水解度為指標，經單因素試驗初步考察酶解溫度、加酶量、底物濃度和pH值4個因素對ProtamexR蛋白酶水解魚膠原蛋白制備ACE抑制活性肽的水解度的影響。

將魚皮膠原蛋白水溶液調整pH值分別在7、8、9、10和11條件下，并在底物濃度5%、加酶量5%和50℃情況下酶解解1 h，研究pH值對魚膠原蛋白水解效果的影響。

設定魚膠原蛋白水解溫度分別為40、50、60、70、80℃并在底物濃度5%、加酶量5%和pH10情況下酶解解1 h，研究溫度對魚膠原蛋白水解效果的影響。

將加酶量分別設定為1%、3%、5%、7%、9%，并在pH10、底物濃度5%和50℃情況下酶解1 h，研究pH值對魚膠原蛋白水解效果的影響。

將魚膠原蛋白底物濃度分別配置為1%、5%、10%、15%、20%，并在pH 10、加酶量5%和50℃情況下酶解解1 h，研究pH值對魚膠原蛋白水解效果的影響。

1.2.3 酶解魚膠原蛋白制備活性肽正交組合設計模型

在單因素試驗基礎上，進行三元二次通用旋轉設計優化，分別考察溫度、加酶量和pH值及其兩兩因素交互作用和因素二次項對水解效果的影響，因素水平見表1。

表1 因素編碼表Table1 Experiment factorscoding table

1.2.4 蛋白質水解度（DH）的測定

水解度測定采用pH-stat法[6]。

1.2.5 血管緊張素轉化酶抑制活性的測定

采用高效液相色譜法，在Wu等[7]方法基礎上進行修改，取30μLHHL底物液，加入10μL抑制劑混合均勻，在（37±0.5）℃恒溫水浴中預熱3min～5min，然后加入20μLACE（2.0 U/mg蛋白）液充分混合，37℃保溫30min后，再加入60μL的1mol/LHCl終止反應，得到反應液，同時用10μL pH為8.3的硼酸緩沖液替代抑制劑溶液作為空白對照組[8]。該反應液用0.45μm濾膜過濾后直接用HPLC系統進行分析。色譜條件：InertsilWP300 C18色譜柱（5μm，125mm× 4.0mm），柱溫25℃，流速0.5mL/min，流動相乙腈/水（0.05%TFA）比例為25/75等梯度洗脫，檢測波長228 nm。

ACE抑制活性計算公式如下：

式中：M為空白對照組中馬尿酸的峰面積；N為添加抑制劑組中馬尿酸的峰面積。

配制不同濃度的魚膠原蛋白源ACE抑制肽的水溶液，按照血管緊張素轉化酶抑制活性測定方法測定進而獲得不同濃度樣品對ACE活性的抑制率，以抑制率對魚膠原蛋白ACE抑制肽濃度（mg/mL）作圖，根據趨勢線獲得抑制率為50%時對應的魚膠原蛋白源ACE抑制肽的濃度，即為半抑制濃度（IC50）。

1.2.6 圓二色譜分析

魚膠原蛋白ACE抑制肽的圓二色譜分析，具體步驟如下：100mmo1/L的硼酸鹽緩沖液（pH 8.3）配制魚膠原蛋白ACE抑制肽溶液，使用厚度為0.2mm的石英樣品池，波長范圍設置為190nm～250nm，活性肽濃度為20mg/mL，檢測溫度為25℃，掃描速度100 nm/min，每個樣品重復掃描3次，并以硼酸鹽緩沖液為空白樣品進行對照。

1.2.7 數據統計分析

采用Origin對數據進行處理分析，樣品測定結果采用平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 pH值對水解效果的影響

pH值對明膠水解度的影響如圖1所示。

圖1 pH值對水解效果的影響Fig.1 Influenceof pH on the degreeofhydrolysis

從圖1中可以看出，當pH值小于10時，隨著pH值的增大，明膠水解度逐漸增大；當pH值等于10時，酶活力較高，水解度最好；當pH值大于10時，隨著pH值的增大，明膠水解度開始下降，因此試驗應在pH值等于10時研究后續的單因素試驗。

2.1.2 溫度對水解效果的影響

溫度對明膠水解度的影響如圖2所示。

圖2 溫度對水解效果的影響Fig.2 Influenceof tem peratureon the degreeof hydrolysis

從圖2中可以看出，溫度在40℃～50℃時，明膠水解液的水解度隨溫度升高而升高；50℃時水解度最好，隨著溫度的升高水解度逐漸下降，這是由于一方面當溫度升高，酶活性增強、反應速度加快；另一方面當溫度持續升高時，酶活性減弱、酶的穩定性降低。因此本試驗應該在溫度為50℃時進行后續試驗。

2.1.3 底物濃度對水解效果的影響

底物濃度對明膠水解度的影響如圖3所示。

圖3 底物濃度對水解效果的影響Fig.3 Influenceof substrate concentration on thedegreeof hydrolysis

從圖中可以看出，當底物濃度大于1%時，隨著底物濃度的增加，明膠水解度逐漸降低；當底物濃度由5%增加至15%時，由于底物濃度的增加，膠原蛋白的水解效果有所降低；當底物濃度繼續增加至20%時，酶促反應開始明顯減慢。綜合考慮選擇底物濃度在15%進行后續的試驗。

2.1.4 加酶量對水解效果的影響

加酶量對明膠水解度的影響如圖4所示。

圖4 加酶量對水解效果的影響Fig.4 Influenceof enzym eaddition on thedegreeof hydrolysis

從圖4中可以看出，當加酶量在小于5%時，隨著加酶量的增加，明膠水解度逐漸增大；當加酶量大于5%時，明膠水解度緩慢增加，由于考慮到復合蛋白酶的利用率，減少酶的用量，降低生產成本。綜合考慮加酶量應在5%。

2.2 三元二次正交組合設計模型的建立

在單因素基礎上進行了正交組合設計，其結果見表2，并進行了回歸系數的顯著性檢驗、回歸方程檢驗和失擬檢驗。

表2 三元二次回歸正交試驗結果Table2 Resu ltsof quad ratic regression orthogonalcombination designed

F回=（S回/f回）/（SR/fR）=6.83＞F0.01（5，11）=5.32，表明方程在0.01水平下顯著，且滿足

Flf＜F0.25（9，2）=3.37，方程不失擬，可見回歸方程擬合的很好。

根據西爾維斯特不等式判別方程的極值[9]，利用求駐點方法求得當水解度取得極值時，x1=1.82；x2= 0.72；x3=0.72，將因素編碼表代入方程中，即在底物濃度為11.8%，酶解pH值為8.7，加酶量5.4%和酶解溫度53.6℃條件下，酶解1 h所得的魚皮膠原蛋白水解度為17%，并經試驗驗證，此條件下對應的膠原蛋白水解度為16.6%與回歸方程優化結果相近。

2.3 魚膠原蛋白肽ACE抑制活性及圓二色譜分析

利用高效液相色譜法對魚膠原蛋白ACE抑制肽的體外活性測定，結果表明其抑制率為45%，具有作為ACE抑制肽開發的潛力。通過圓二色譜分析魚膠原蛋白ACE抑制肽的空間結構，結果表明主要存在無規卷曲結構，而未形成穩定的α螺旋、β轉角和β折疊結構。

3 結論

本文以魚膠原蛋白為原料，選用ProtamexR蛋白酶進行酶解并獲得最優酶解參數，即在底物濃度為11.8%，酶解pH值為8.7，加酶量5.4%和酶解溫度53.6℃條件下，酶解1 h，利用高效液相色譜法對魚膠原蛋白肽的ACE抑制活性進行測定結果表明其抑制率達到45%，且圓二色譜結果表明活性肽溶液以無規卷曲空間構型為主。

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Enzyme Hydrolysis Preparation M odel of Collagen-derived ACE Inhibitory Peptides Based on Quadratic General Rotation Design

YU Zhi-peng1，ZHANGShuang1，ZHAOWen-zhu1，*，ZHANGQian1，SHEN Jun-tong1，WANGYu1，HUOQian-qian1，LIJian-rong1，*，LIU Jing-bo2
（1.Collegeof Food Scienceand Engineering，BohaiUniversity，National&Local JointEngineering Research Centerof Storage Processingand Safety Control Technology for Fresh Agriculturaland Aquatic Products，Jinzhou 121013，Liaoning，China；2.Lab ofNutrition and Functional Food，Jilin University，Changchun 130062，Jilin，China）

Fish-derived collagenwashydrolyzed by protamexRprotease andmeasured by the degree ofhydrolysis.Thehydrolysismodelofpeptides from fish-derived collagen wasestablished through quadratic general rotation design followed single factorexperiment，subsequently ACE inhibitory activity and secondary structure of fish collagen-derived peptideswasmeasured.The resultsshowed that the equation for theoptimal regression equation had amaximal value according to regression coefficient test，regression equation，and the lack of fit test.The optimal details ofenzymatic hydrolysiswas followed：substrate concentration 11.8%，enzymatic hydrolysis pH value 8.7，the amountofenzyme 5.4%and hydrolysis temperature 53.6℃，and hydrolysis degree of fish-derived collagen was 16.6%in one hour.In vitro ACE inhibitory activity of bioactive peptides from fish-derived collagen was performed by high performance liquid chromatography，and the value ofactivity against ACE was 45%.In addition，secondary structure of fish collagen-derived ACE inhibitory peptide was random coil.

fish-derived collagen；angiotensin convertingenzyme（ACE）；bioactivepeptide；secondary structure

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.013

2016-08-03

2016-09-07

國家科技支撐課題（2012BAD00B03）；遼寧省科學事業公益研究基金項目（2016004004）；渤海大學博士啟動項目（0515bs079）；遼寧省科技攻關項目（2015103020）

于志鵬（1984—），男（漢），講師，博士，研究方向：蛋白質及活性肽的功能研究與產品開發。

*通信作者：趙文竹（1986—），女，講師，博士，研究方向：營養與功能食品；勵建榮（1964—），男，教授，博士，研究方向：水產品加工。