白靈菇多糖的提取及其免疫活性研究

李志濤，孫金旭，王倩，周紅菊，楚志峰

（衡水學院生命科學學院，河北衡水053000）

白靈菇多糖的提取及其免疫活性研究

李志濤，孫金旭，王倩，周紅菊，楚志峰

（衡水學院生命科學學院，河北衡水053000）

通過L18（37）正交試驗，研究了物料粒度、料液比、微波功率、微波時間、提取溫度、微波提取次數、乙醇與濃縮液比值這7個因素對白靈菇多糖得率的影響。試驗結果表明：物料粒度、料液比、微波功率、微波時間、微波提取次數對白靈菇多糖得率均有顯著地影響。并確定提取白靈菇多糖的最佳參數為：物料粒度0.150mm、料液比1∶20（g/mL）、微波功率300W、微波時間6min、提取溫度90℃、微波提取次數3次、乙醇與濃縮液比值4∶1（體積比）。在最佳條件下，白靈菇多糖提取率可達9.31%。通過小鼠脾淋巴細胞增殖的實驗表明，在適當的劑量下，提取到的白靈菇多糖能明顯提高小鼠的免疫功能。

白靈菇；多糖；提取；免疫活性

白靈菇是一種珍貴的食藥兩用的大型真菌，其營養價值和醫療保健功能很高。白靈菇多糖為其主要的生物活性成分[1]。目前國內常用熱水法、堿溶液浸提法等方法提取白靈菇多糖[2-3]。但這些提取方法制備工藝繁瑣，提取率也較低，目前，較新型的微波提取法具有操作簡單、提取率高等優點[4]。而采用微波法提取白靈菇多糖的報道很少，為此，我們采用微波法提取白靈菇多糖，以白靈菇多糖為產物進行試驗，以期確定提取白靈菇多糖的最佳參數，提高白靈菇多糖提取率，并對提取的多糖進行免疫活性研究，為進一步開發白靈菇提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

白靈菇：衡水學院食品學實驗室提供。

1月齡清潔級小鼠：購自天津醫科大學，體重為（20±2）g。

無水乙醇、無水乙醚、丙酮、苯酚：天津市金衛爾化工有限公司；葡萄糖：泰州市興華化學品有限公司；濃硫酸：石家莊鑫隆威化工有限公司；以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

FA1004C型電子天平：上海市平軒科學儀器公司；722型分光光度計：上海市美析儀器公司；VIP271型微波爐：順德市惠爾浦蜆華微波制品公司。

1.2 方法

1.2.1 微波法提取白靈菇多糖[5]

1.2.1.1 提取工藝

白靈菇→粉碎（粉碎后分別過不同孔徑篩網，調節物料粒度）→加蒸餾水（調節料液比）浸泡20min→微波輻射（分別調節微波功率、輻照時間、提取溫度）→離心得上清液→濃縮至原體積的1/4→加入乙醇沉淀（調節乙醇用量與濃縮液比值）→4℃靜置24 h→離心得沉淀→無水乙醇、丙酮分別洗滌→低溫干燥→白靈菇多糖

1.2.1.2 正交試驗

選用物料粒度、料液比、微波功率、微波時間、提取溫度、微波提取次數、乙醇與濃縮液比值為試驗因素，前期單因素試驗研究了這7個因素對白靈菇多糖提取的影響。本試驗根據前期單因素試驗結果，用L18（37）正交表來設計正交試驗。L18（37）正交表的因素水平見表1。

表1 L18（37）正交試驗因素水平表Table1 L18（37）orthogonalexperim entaldesign factorsand level

1.2.1.3 白靈菇多糖的測定[6]

采用苯酚-硫酸法測定多糖。以葡萄糖的毫克數為橫坐標，吸光度值（波長490 nm）為縱坐標，測得標準曲線（圖1），回歸方程為：y=6.735 2x，相關系數R2= 0.999 2。然后測定白靈菇多糖樣品吸光度，根據標準曲線回歸方程，計算樣品中的多糖含量。

圖1 苯酚-硫酸標準曲線Fig.1 Standard curveof phenol-vitriol

1.2.2 白靈菇多糖免疫調節活性的測定[7]

拉頸處死小鼠，無菌操作下取脾制備成細胞懸液。在96孔酶標板的每個孔中，加入100μL細胞懸液，再加20μL完全培養液為陰性對照；加10μLCon A（刀豆蛋白A），10μL完全培養液為陽性對照；實驗組取白靈菇多糖樣品，分別配制成1、2、3、4、5、6、7、8 mg/mL的溶液，加入10μL樣品溶液和10μLConA于每個試驗孔上，然后置于CO2培養箱（5%CO2、37℃）中，孵育72 h。在培養結束前6小時時，每孔加10μL新配制的無菌MTT（噻唑藍，5mg/mL）。培養結束以后，每孔加入100μL 10%的SDS（十二烷基硫酸鈉）來終止反應，測OD490nm值（光密度）。用刺激指數（Stimulate index，SI）來表示免疫調節活性，SI值越大，說明提取的白靈菇多糖的免疫調節活性越強。刺激指數的計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 以白靈菇多糖為目的產物的試驗分析

正交試驗對白靈菇多糖得率影響的數據分析見表2、表3。

表2 L18（37）正交試驗對白靈菇多糖得率影響分析Table2 L18（37）Orthogonal testanalysisof the impactof polysaccharide yield

表3 L18（37）正交試驗對白靈菇多糖得率影響的顯著性分析Table3 L18（37）orthogonal testof the impactof significant polysaccharide yield analysis

由表2、表3得知，物料粒度、料液比、微波功率、微波時間、微波提取次數對白靈菇多糖得率均有顯著地影響，其它因素影響不顯著。按各因素對白靈菇多糖得率的影響的重要性而論：C＞A＞D＞B＞F＞E＞G，即微波功率＞物料粒度＞微波時間＞料液比＞微波提取次數＞提取溫度＞乙醇與濃縮液比值。由以上結果可知微波功率對白靈菇多糖得率的影響最大，并確定最佳試驗組合為A2B1C2D2E3F3G2，即物料粒度0.150mm、料液比1∶20（g/mL）、微波功率300W、微波時間6min、提取溫度90℃、微波提取次數3次、乙醇與濃縮液比值4∶1（體積比）。

2.2 驗證試驗

由2.1確定正交試驗最優組合為A2B1C2D2E3F3G2，采用此最佳組合進行驗證試驗，做3個平行樣，取平均值后計算多糖得率為9.31%，此結果與正交試驗最高值相比，多糖得率提高6.04%，說明優化結果較有意義。

2.3 免疫調節活性的測定

不同濃度的白靈菇多糖對小鼠脾淋巴細胞免疫調節活性影響見圖2。

圖2 不同濃度的多糖對小鼠免疫調節活性的影響Fig.2 Effectsof differentdosagesof sam pleson splenic lym phocyte multiplication

如圖2所示，不同濃度的多糖的刺激指數均大于1（SI＞1），表明提取的白靈菇多糖對小鼠脾淋巴細胞的增殖活性具有促進作用，因此其對小鼠具有較好的免疫增強的作用。隨著樣品濃度的提高，其對小鼠脾淋巴細胞的增殖活性的促進作用逐漸增強，但當樣品濃度在超過5mg/mL時，隨著樣品濃度的增加，小鼠脾淋巴細胞免疫調節活性增加的速度就非常緩慢，其機理有待于進一步研究。

3 結論

本文采用微波輔助提取法，通過正交試驗確定提取白靈菇多糖的最佳試驗參數為：物料粒度0.150mm、料液比1∶20（g/mL）、微波功率300W、微波時間6min、提取溫度90℃、微波提取次數3次、乙醇與濃縮液比值4∶1。然后按照最優組合進行了驗證試驗，得白靈菇多糖提取率為9.31%，結果證明該組合與未優化組合相比較，白靈菇多糖得率較高，而且其提取率遠高于熱水法（提取率為6.39%）或堿溶液浸提法提取的白靈菇多糖提取率（提取率為1.43%）[2-3]。并且通過免疫調節活性實驗得知，在適宜濃度下，白靈菇多糖能明顯的提高小鼠免疫功能，這為進一步開發具有免疫調節活性的功能食品提供了理論基礎。

[1]馬淑鳳,陳利梅,徐化能,等.白靈菇多糖的分離純化及清除自由基研究[J].食品科學,2009,30(19)：109-113

[2]馬淑鳳,劉長江.熱水法提取白靈菇菌絲體多糖(PNMP)工藝的優化[J].食用菌,2009,31(1)：65-67

[3]劉海英,范永山,張運峰,等.白靈菇菌絲多糖堿溶液浸提法提取工藝的改進[J].北京農學院學報,2009,24(3)：55-58

[4]Bhattacharya M,Basak T,Senagala R.A comprehensive theoretical analysis for the effectofmicrowave heatingon the progressof a first orderendothermic reaction[J].Chemical Engineering Science,2011, 66(23)：5832-5851

[5]郭永月,陶明煊,趙云霞,等.白玉菇多糖提取方法的比較和優化[J].南京師大學報(自然科學版),2013,36(3)：87-92

[6]孫金旭,朱會霞,韓莉萍.靈芝真菌液體發酵培養基優化[J].中國釀造,2008,23(14)：52-54

[7]李志濤,梁魁景,馬儷珍,等.鯰魚體表黏液IgM的免疫活性研究[J].湖北農業科學,2013,52(1)：152-154,167

A Study on the Extraction and Immune Effect of Polysaccharide from Pleurotus nebrodensis

LIZhi-tao，SUN Jin-xu，WANGQian，ZHOUHong-ju，CHU Zhi-feng
（Departmentof Life Sciences，HengshuiUniversity，Hengshui053000，Hebei，China）

Theeffectofmaterialsize，the ratioofmaterial to liquid，microwave power，microwave time，extraction temperature，times andmultiple of ethanol on the yield of polysaccharide from Pleurotus nebrodensis was studied through L18（37）orthogonal experiment.Orthogonalexperimentanalysis showed thatmaterial size，the ratio ofmaterial to liquid，microwave power，microwave time and timesappreciable impact.The optimum conditionswere：material sizewas 0.150mm，the ratio ofmaterial to liquid was 1∶20（g/mL），microwave power was300W，microwave timewas6min，extraction temperaturewas90℃，timeswas3 andmultiple ofethanol was4∶1（ratiosof the volume）.Under the optimal circumstances，the extraction rate ofpolysaccharide could be up to 9.31%.The experiment of lymphocyte proliferation ofmouse's spleen showed that polysaccharide from Pleurotusnebrodensis atmoderate dose significantly promoted the immunologic function inmice.

Pleurotusnebrodensis；polysaccharides；extraction；immunoregulatoryactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.012

2016-06-15

李志濤（1983—），男（漢），講師，碩士，研究方向：食品科學。