內生枯草芽孢桿菌BS35發酵的優化配方實驗

李曉舟

SAS（StatisticalAnalysisSystem）軟件是可完成統計分析、運籌問題等大量模塊的集成軟件系統。借助SAS軟件可方便地定量分析各因素對發酵實驗結果的影響，使優化后的工藝科學性強、重現性好、可信度高。其中Plackett-Burman設計法（諸因素內重要因子的篩選方法）采用兩水平的試驗設計，用最少的試驗次數盡可能精確估計因素中的主效果，可在眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素。可選擇可信度大于90%（或85%）的因素作為重要因素進行下一步試驗，與目前常用的部分因子實驗和隨機平衡實驗相比，該方法最為高效、準確。根據Plackett-Burman設計的結果，從眾因素中篩選出重要因子，以原濃度為基礎，以一定濃度為梯度進行最陡爬坡實驗，從而確定重要因子的濃度范圍。響應面分析法（RSA）是綜合試驗分析和數學建模最經濟合理的實驗設計，是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法。彌補了以前在微生物培養基優化方面的不足，是近年來應用最多的一種優化技術。Placket-Burman法和響應面分析法已被成功地運用于微生物發酵條件的優化研究中。Konyaetal（1998）采用RSA和最速增長途徑法來研究培養基最佳濃度，提高康帕汀產率62%，而工作量比常規實驗減少40%左右。Ismail（1999）、張麗霞（2006）、曹小紅（2007）、周波（2008）、牛芳方（2009）等在研究發酵生產中成功地應用了Plackett-Burman設計法及RSA，高效快速地獲得了優化工藝。

本研究的目的是通過優化發酵培養基配方，提高發酵液中的菌體數量和芽孢含量，降低生產成本，提高生產效率為大規模工業化生產奠定基礎。

1.材料和方法

1.1 供試菌株

枯草芽孢桿菌BacillussubtilisBS35。

1.2 液體種子液制備

BS35經過LB平板活化后，挑取單菌落，接種于液體LB培養基中，于29℃、140rpm培養16h。

1.3 培養基

參照劉林、張麗霞（2006）枯草芽孢桿菌發酵培養基配方

1號發酵培養基：黃豆粉49.5g，玉米粉25.3g，酵母浸粉，K2HPO41.1g，MgSO40.1g，CaCl20.1g，MnSO41.5g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

2號發酵培養基：玉米粉3g，黃豆粉3g，葡萄糖0.5g，MnSO42g，K2HPO43g，KH2PO41.5g蒸餾水1000ml，pH8.0；

3號發酵培養基：玉米粉1.0g，黃豆粉30.0g，MnSO41.0g，K2HPO43g，KH2PO41.5g，葡萄糖15.0g，硫酸鎂0.5g，酵母浸粉0.2g，氯化鐵0.1g，碳酸鈣0.1g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

4號發酵培養基：葡萄糖50.0g，黃豆粉30.0g，酵母浸粉10.0g，碳酸鈣7.0g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

5號發酵培養基：玉米粉10.0g，葡萄糖5.0g，黃豆粉15.0g，碳酸鈣5.0g，硫酸胺1.0g，磷酸氫二鉀0.3g，硫酸鎂·7H2O，硫酸錳·H2O0.2g蒸餾水1000ml，pH8.0；

6號發酵培養基：玉米粉3.0g，葡萄糖3.0g，黃豆粉3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，MgSO4.7H2O0.4g，硫酸亞鐵0.02g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

7號發酵培養基：葡萄糖10.0g，玉米粉20.0g，黃豆粉15.0g，硫酸錳0.1g，硫酸鎂0.1g，碳酸鈣2.0g，酵母浸粉3.0g，硫酸亞鐵0.02g，磷酸氫二鉀2.0g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

8號發酵培養基：玉米粉5.0g，葡萄糖3.0g，豆餅粉5.0g，魚粉3.0g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

9號發酵培養基：玉米粉46.0g，豆餅粉35.0g，葡萄糖1.0g，K2HPO43.2g，MgSO4·7H2O0.1g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

10號發酵培養基：玉米粉10.0g，葡萄糖5.0g，豆餅粉15.0g，魚粉5.0g，CaCO35.0g，（NH4）2SO41.0g，K2HPO40.3g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·H2O0.2g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

1.4芽孢染色法

芽孢染色：孔雀綠染色法，按革蘭氏染色涂片后，加孔雀綠染色液3-4滴，用木莢夾住載玻片，在火焰上加熱，使有蒸汽產生，但勿使沸騰，如此反復染色10min。在染色中，依據蒸發情況隨時添加染色液或水，使涂面上保持不干。用清水沖洗約半分鐘，至無多余染色液流下為止。用2%番紅染色3min，水洗，晾干。鏡檢。芽孢呈綠色，菌體和芽孢囊呈微紅色。

1.5含菌量測定

將已培養42h的發酵培養液進行梯度稀釋，取100μl在LB平板培養基上涂板，24h后記錄菌落數量，計算cfu/ml。

1.6芽孢形成率

以染色后顯微鏡下觀察計算，一個視野中100個細胞中芽孢的數量。芽孢形成率=（芽孢的數量/100）×100%

1.7發酵條件

250ml三角瓶中按100ml培養基的裝液量，調其初始pH值到8.0，以6%的接菌量接種子培養液，于29℃、140rpm振蕩培養。

1.8培養基配方優化設計方案

通過Plackett-Burman設計法對初始發酵基礎培養基中各種成份的影響效應進行評價，篩選出有顯著影響效應的因素，然后利用最陡爬坡路徑實驗逼近重要因素的最適濃度范圍，確定后續實驗中心點，再通過響應分析法（ResponseSurfaceAnalysis，RSA）確定最佳發酵配方，最后進行模型驗證。

1.8.1Plackett-Burman設計法篩選培養基中重要因子：應用Plackett-Burman設計法全面考察初始發酵基礎培養液中6個成分的影響效應，篩選培養基中影響發酵液含菌量的重要因子。在SAS軟件中調出實驗設計表格，各因子設置高低兩水平，低水平為初始發酵基礎培養基各成分的濃度，高水平為低水平的1.5倍。Plackett-Burman實驗因素及水平列表（g/L）

1.8.2 最陡爬坡實驗接近最大響應面區域：由Plackett-Burman實驗回歸分析確定重要因素，根據試驗結果進行數據分析得出各因素的t值和可信度，一般選擇可信度大于90%或85%以上的因素作為重要因素，并根據這些因素對發酵液活菌數的正影響（T值為正）或負影響（T值為負）設計最陡爬坡路徑實驗，增加或減少重要因素在培養基中的濃度，其余因素均取低水平即初始發酵基礎培養液的濃度，考察發酵液中菌體數的變化趨勢，確定重要因素的最適濃度范圍。

1.8.3響應面分析試驗設計篩選重要因素的最優濃度水平：根據Plackett-Burman實驗確定了影響芽孢形成數量的重要因素，再以最陡爬坡實驗確定接近響應值區域的重要因素的濃度，運用Box-Behnken法進行響應面分析實驗，確定重要因素的水平。