金銀花花器官實時熒光定量PCR內參基因的篩選

劉霞宇，陳亮，喬永剛，宋蕓，王金勝

（山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西太谷030801）

金銀花花器官實時熒光定量PCR內參基因的篩選

劉霞宇，陳亮，喬永剛，宋蕓，王金勝

（山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西太谷030801）

為了篩選金銀花花器官基因表達分析的適宜內參基因，試驗以金銀花花器官6個時期為材料，選取金銀花的9個候選內參基因Lonja.ACT11，Lonja.ACT2/7，Lonja.G6PD，Lonja.GAPDH，Lonja.MTP，Lonja.TUA，Lonja. UBQ10，Lonja.EF1A，Lonja.UBC，利用qRT-PCR技術及GeNorm，NormFinder軟件對它們的表達穩(wěn)定性進行分析評價。結果表明，Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD在金銀花花器官生長的不同時期表達水平較穩(wěn)定，運用qRT-PCR研究金銀花花器官基因表達時可選用Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD組合作為內參基因。

實時熒光定量PCR；金銀花花器官；內參基因

基因表達在生物研究的許多領域都非常重要[1]。相比于傳統(tǒng)的轉錄組分析，實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）[2]是檢測mRNA最可信的方法[3]。其具有高靈敏性、高通量以及特異性高、動態(tài)范圍廣等優(yōu)點[4]，但同時也存在一些困難，最重要的就是內參基因的標準化。

在進行植物qRT-PCR研究時通常選用管家基因作為內參，比如肌動蛋白（actin，ACT）、微管蛋白（tublin，TUA，TUB）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）、核糖體RNA（ribosomal RNA，18sr RNA，28sr RNA）、延伸因子（elongation factor1-α，EF1-α）等[5]。然而，在許多情況下這些基因的表達水平并不是很穩(wěn)定，甚至會導致錯誤的試驗結果[6-7]。所以，在用qRT-PCR技術進行基因表達研究時要提前篩選適合試驗條件的內參基因。目前，常用篩選內參基因的軟件有GeNorm[8]和NormFinder[9]。

金銀花（Lonicera japonica Thunb.）又名忍冬，為忍冬科多年生半常綠纏繞木質藤本植物，根據(jù)金銀花花色的變化，可以將金銀花開花過程分為米蕾期、三青期、二白期、大白期、銀花期、金花期[10]。金銀花商品以花蕾為佳，其性甘寒、氣芳香，在中醫(yī)藥學中多作為宣散風熱、清解血毒等配方，是一種常見的中醫(yī)藥學藥用植物[11]。另外，金銀花可作為食物，也普遍被認為是一種健康飲品，所以使得金銀花在中草藥市場的商業(yè)價值快速上升[12]。

目前，國內外已有很多關于金銀花的研究報道，主要集中在化學成分[13]、質量[14]、生態(tài)價值[15]等方面。

本試驗對金銀花花器官的6個時期：米蕾期、三青期、二白期、大白期、銀花期、金花期進行取材，通過qRT-PCR技術對9個候選內參基因Lonja.ACT11，Lonja.ACT2/7，Lonja.G6PD，Lonja.GAPDH，Lonja.MTP，Lonja.TUA，Lonja.UBQ10，Lonja.EF1A和Lonja.UBC進行穩(wěn)定性分析，旨在為研究金銀花花器官的基因表達qRT-PCR分析奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選擇長勢一致的金銀花植株（種植于山西省晉中市太谷縣山西農(nóng)業(yè)大學山西天然藥用生物研究院），分別在其米蕾期、三青期、二白期、大白期、銀花期、金花期進行取材。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第1鏈合成利用北京華越洋植物RNA提取試劑盒提取各個樣品的總RNA，步驟參照說明書進行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，RNA的濃度和純度用Nanodorp 2000c測定。反轉錄按照全式金TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒的方法進行，每個樣品分別以100 ng/μL總RNA為模板進行反轉錄，得到的產(chǎn)物部分用于普通PCR，部分凍存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光定量PCR引物的設計通過前期大量的文獻閱讀，找出植物中常用的qRT-PCR內參基因（9個），利用生物信息學方法從山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院藥用植物育種實驗室已得到的金銀花轉錄組數(shù)據(jù)中找出它們的同源基因。根據(jù)熒光定量PCR引物的設計原則，利用在線引物設計軟件IDT PrimerQuest Tool（http://sg.idtdna.com/PrimerQuest/H ome/Index）分別設計Lonja.ACT11，Lonja.ACT2/7，Lonja.G6PD，Lonja.GAPDH，Lonja.MTP，Lonja.TUA，Lonja.UBQ10，Lonja.EF1A，Lonja.UBC引物（表1）。

表1 候選內參基因引物信息

1.2.3 內參基因的特異性檢驗用內參基因的普通PCR檢測其特異性：試劑為中科瑞泰2×Taq PCR MasterMix。反應體系列于表2。反應程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

表2 普通PCR反應體系（20 μL）

1.2.4 熒光定量PCR反應用全式金TransStartrRTip Green qPCR SuperMix試劑盒進行qRT-PCR反應，每個樣品3次生物學重復。反應體系列于表3。反應程序為94℃預變性30 s；94℃變性5 s，57℃退火15 s，72℃延伸10 s，45個循環(huán)；特異性檢測：以0.5℃/5 s的速率從70℃上升到95℃，期間讀取熒光信號值，繪制熔解曲線。

表3 qRT-PCR反應體系（10 μL）

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)熒光定量儀給出的數(shù)據(jù)，利用GeNorm，NormFinder軟件分析內參基因的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 RNA質量檢測

金銀花花器官的總RNA經(jīng)檢測可知，A260/A280的值均在2.0左右，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示（圖1），28S的亮度約為18S的2倍，說明試驗提取的RNA完整性良好，可用于后續(xù)的試驗。

2.2 內參基因的特異性檢驗

從圖2可以看出，每個基因的產(chǎn)物為單一條帶，表明有較高的專一性，而且產(chǎn)物片段在79～150 bp，與預測結果一致，說明設計的引物可用于進一步試驗。

2.3 內參基因的選擇

利用GeNorm軟件通過計算基因的表達穩(wěn)定值（M）評價基因表達的穩(wěn)定性，基因的M值越小越穩(wěn)定。由圖3可知，金銀花花器官中9個候選內參基因穩(wěn)定性大小依次是Lonja.ACT2/7＝Lonja.G6PD＞Lonja.GAPDH＞Lonja.MTP＞Lonja.ACT11＞Lonja. UBC＞Lonja.EF1A＞Lonja.UBQ10＞Lonja.TUA。由圖4可知，V2/3小于閾值0.15，說明沒有必要引入第3個內參。NormFinder軟件計算結果表明（表4），Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD表達較穩(wěn)定，Lonja. UBQ10和Lonja.TUA穩(wěn)定性較差。2個軟件得到的結果一致，在一定程度上驗證了結果的可靠性。

表4 NormFinder軟件計算結果

3 討論與結論

目前，在藥用植物領域有一些關于篩選內參基因的研究。侯維海等[16]研究發(fā)現(xiàn)，TIP41和UBQ10在地黃花器官中表達穩(wěn)定，而在地黃根、莖、葉中TIP41和UBQ5表達穩(wěn)定。張崗等[17]以我國名貴中藥材鐵皮石斛為材料，研究發(fā)現(xiàn)，最適內參基因為EF-1α和18S rRNA。李金弟[18]以托品烷類生物堿藥源植物顛茄作為研究對象進行研究，結果表明，PKG是其一個可靠的內參基因。蔡嘉洛等[19]研究發(fā)現(xiàn)，18S rRNA是灰氈毛忍冬的適宜內參基因。說明不同種類的藥用植物最適的內參基因不同，同一物種不同的組織、器官最適宜的內參基因也不同。因此，在進行基因表達研究前，篩選適合試驗的內參基因是非常必要的。

本試驗通過qRT-PCR技術，篩選出金銀花花器官的最適內參基因為Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD，運用qRT-PCR研究金銀花花器官基因表達時可選用Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD組合作為內參基因，這為金銀花花器官基因表達研究奠定了基礎。

［1］WANH J，ZHAOZG，QIANCT，et al.Selection ofappropriate reference genes for gene expression studies by quantitative real-time polymerase chain reaction in cucumber[J].Analytical Biochemistry，2010，399：257-261.

［2］IZASKUN MALLONA，SANDRA LISCHEWSKI，JULIA WEISS，et al.Validation ofreference genes for quantitative real-time PCR during leaf and flower development in Petunia hybrida[J].BMC Plant Biology，2010，10：4.

［3］JIAN B，LIU B，BI Y，et al.Validation of internal control for gene expression study in soybean by quantitative real-time PCR[J].BMC Molecular Biology，2008，9（1）：59.

［4］MUKESH JAIN，AASHIMA NIJHAWAN，AKHILESH K.Validation of housekeeping genes as internal control for studying gene expression in rice by quantitative real-time PCR[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，345（2）：646-651.

［5］LIBAULT M，THIBIVILLIERS S，BILGIN D D，et al.Identification of four soybean reference genes for gene expression normalization[J]. The Plant Genome，2008，1（1）：44-54.

［6］VOLKOV R A，PANCHUK I I，SCHOFFL F.Heat-stress-dependency and developmental modulation of gene expression：the potential ofhouse-keepinggenes as internal standards in Mrna expression profiling using real-time RT-PCR[J].Journal of Experimental Botany，2003，54：2343-2349.

［7］REMANS T，SMEETS K，OPDENAKKER K，et al.Normalisation of real-time RT-PCR gene expression measurements in Arabidopsis thaliana exposed to increased metal concentrations[J].Planta，2008，227（6）：1343-1349.

［8］VANDESOMPELE J，DEPRETER K，PATTYN F，et al.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].Genome Biology，2002，3（7）：1-11.

［9］ANDERSENCL，JENSENJ L，OENTOFTTF.Normalization ofrealtime quantitative reverse transcription-PCR data：A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization，applied to bladder and colon cancer datasets[J].Cancer Research，2004，64（15）：5245.

［10］任玉鋒，馬永平，王文麗.金銀花花色素的種類和含量的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2015，43（2）：90-93.

［11］陳繼明，洪超群.金銀花藥理作用分析[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2015，11（5）：43-44.

［12］WANG L J.The study progress of Lonicera japonica[J].Med Inform，2010，8：2293-2296.

［13］姜南輝.金銀花化學成分研究[J].中藥材，2015，38（2）：315-317.

［14］李建軍，賈國倫，李靜云，等.金銀花不同花期花蕾質量及指標成分含量比較分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2013，42（10）：110-114.

［15］郭瑞齊，劉晉仙，胡春苗，等.山東道地藥材金銀花逆境響應機制研究進展[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2016，48（2）：154-156.

［16］侯維海，孫鵬，陳全家，等.地黃實時定量PCR內參基因的篩選[J].中國農(nóng)學通報，2011，27（17）：76-82.

［17］張崗，趙明明，張大為，等.鐵皮石斛實時定量PCR內參基因的篩選[J].中國藥學雜志，2013，48（19）：1664-1668.

［18］李金弟.顛茄內參基因篩選及基因表達分析[D].重慶：西南大學，2013.

［19］蔡嘉洛，朱貽霖，謝舒平，等.灰氈毛忍冬內參基因篩選和Mads-box家族基因AGL15的時空表達分析[J].中草藥，2016，47（15）：2727-2733.

Selection of Reference Genes by qRT-PCR in Flower Organ ofLonicera japonicaThunb.

LIUXiayu，CHENLiang，QIAOYonggang，SONGYun，WANGJinsheng
（College ofLife Science，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The study aimed to select stable and optimal reference genes for gene expression analysis in flower of Lonicera japonica Thunb.,taking 6 periods of Lonicera japonica Thunb.as materials.A total of nine reference genes including Lonja.ACT11,Lonja. ACT2/7,Lonja.G6PD,Lonja.GAPDH,Lonja.MTP,Lonja.TUA,Lonja.UBQ10,Lonja.EF1A,Lonja.UBC were compared by qRT-PCR.The stability of expression of the nine reference genes were evaluated by GeNorm and NormFinder software.The results showed that Lonja.ACT2/7 and Lonja.G6PD were the most suitable reference genes among different periods of flower organ,Lonja. ACT2/7 and Lonja.G6PD were used as the reference gene in the studyofgene expression ofhoneysuckle flower organs byqRT-PCR.

qRT-PCR;flower organ ofLonicera japonica Thunb.;reference genes

S567.7＋9

A

1002-2481（2017）04-0514-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.06

2016-10-04

山西省科技攻關項目（20140312001-2）；山西農(nóng)業(yè)大學橫向項目（2014HX60）

劉霞宇（1991-），女，山西方山人，在讀碩士，研究方向：生物化學與分子生物學。王金勝為通信作者。