反相高效液相色譜法同時測定黃酒中4種游離嘌呤

劉鎮，王靈芝，章姍姍，葛樂勇，諸葛慶，曾紅燕

（紹興市食品藥品檢驗研究院，國家黃酒產品質量監督檢驗中心，浙江紹興312000）

反相高效液相色譜法同時測定黃酒中4種游離嘌呤

劉鎮，王靈芝，章姍姍，葛樂勇，諸葛慶，曾紅燕

（紹興市食品藥品檢驗研究院，國家黃酒產品質量監督檢驗中心，浙江紹興312000）

建立了一種簡單、快捷的黃酒中4種游離嘌呤含量的高效液相色譜分析方法。在0.5～20mg/L濃度范圍內，各嘌呤的響應值與其相應濃度呈良好線性關系，相關系數大于0.9990，相對標準偏差在0.8%～1.5%，檢出限在0.02～0.17mg/L，加標回收率在89%～105%，符合分析測試要求。實驗黃酒中游離腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤及黃嘌呤的含量分別為4.30mg/L、1.29mg/L、2.93mg/L與3.92mg/L。

嘌呤；黃酒；高效液相色譜

嘌呤是一種生物堿，由一個嘧啶環和一個咪唑環稠合而成，主要包括腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤及其衍生物等。在人體內嘌呤代謝會變成尿酸，其中黃嘌呤是尿酸的直接來源，而次黃嘌呤和鳥嘌呤是尿酸的間接來源，二者均是在黃嘌呤氧化酶的作用下被氧化為黃嘌呤，最后黃嘌呤被氧化為尿酸。尿酸是人體內一些有害活性物質的有效清除劑，包括羥自由基、超氧負離子、單態氧及高鐵血紅素等[1]，因此嘌呤代謝正常的人食用含嘌呤較高的食物對機體是有益的。但是經常進食高嘌呤類食物，使腎臟不能將過多的嘌呤代謝物經尿液排出，會造成血液尿酸的濃度超過正常值，尿酸鹽晶體可沉積于關節、軟組織、骨骼和腎臟等處，從而引發一系列疾病，如痛風病、高尿酸血癥、腎臟疾病等等[2-3]。

目前關于酒類食物中嘌呤的研究主要集中在啤酒上[4]，其他酒類中嘌呤的研究則罕見報道。黃酒屬于非蒸餾酒，也含有一定量的嘌呤。對黃酒中嘌呤的檢測研究可為補充完善我國食物成分數據庫提供數據，為痛風等嘌呤代謝障礙性疾病患者的健康飲酒提供參考。

反相色譜是目前嘌呤最常用的分離模式[5-6]。微粒填料技術、化學鍵合技術以及合適的流動相使反相色譜系統能有效、快速分離許多化合物。本實驗通過反相高效液相色譜法同時測定黃酒中游離的腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤及黃嘌呤，建立了一種方便、快捷的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品：市售某品牌黃酒。

試劑：腺嘌呤（BR）、鳥嘌呤（BR）、黃嘌呤（BR）、次黃嘌呤（BR）、85%磷酸（AR）、KH2PO4（AR）、NaOH（AR），所有試劑均由國藥集團化學試劑有限公司生產。

儀器：高效液相色譜儀（Agilent1260），精密電子天平（梅特勒-托利多，ME204E），酸度計（梅特勒-托利多，S220）。

1.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6mm× 250 mm，5μm）；柱溫：25℃；流動相：0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液（pH4.0）；流速：1m L/m in；進樣量：20μL；檢測器：紫外檢測器（UV）；檢測波長：254 nm。

1.3 標準曲線

準確稱取腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤標樣25mg，分別用超純水定容至25m L，配制濃度為1mg/m L的標準儲備溶液（嘌呤不易溶于水，可加入NaOH溶液助溶）。將標準儲備溶液稀釋配制成標準系列濃度：0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L。在上述色譜條件下進行分析，以每種物質的峰面積與標樣濃度做線性回歸曲線。

1.4 樣品測定

將待測黃酒樣品用0.45μm針式過濾頭過濾，濾液進行HPLC分析。

2 結果分析

2.1 色譜分析條件的確認

嘌呤為弱極性堿性化合物，可采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱分析。柱溫、流動相組分、流動相pH值和流速等對4種嘌呤的分離效果均有一定的影響，參考他人的研究成果[7-8]發現，以0.02mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液（pH4.0）為流動相，在1m L/m in流速下，25℃柱溫時，4種嘌呤在15m in內可達到完全分離（見圖1），出峰順序依次為鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤，與文獻結果一致。

圖1 4種嘌呤標準品色譜圖

鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤均有共軛雙鍵，在紫外區有強烈的吸收，其吸收峰在220～300 nm之間。用二極管陣列檢測器（DAD）對嘌呤標樣進行檢測，并保存全光譜，結果見圖2。綜合考慮各種嘌呤的吸收峰，選擇以254 nm作為檢測波長。

圖2 4種嘌呤標準品的全光譜圖

2.2 標準曲線方程和相關系數

在上述方法條件下，分別將配制的各組分濃度為0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L的混合標準溶液注入液相色譜儀進行分離測定，以峰面積與標樣濃度繪制標準工作曲線，結果見表1。由表1可知，在0.5～20mg/L濃度范圍內，4種嘌呤的峰面積響應值與濃度呈良好的線性關系，相關系數R2大于0.9990。

2.3 精密度和檢出限

同一樣品連續進樣6次，在相同的條件下進行色譜分析，根據測定結果計算相對標準偏差RSD，結果顯示RSD值均小于2%（見表2）。說明本方法重復性良好，符合分析檢測試驗的要求。以信噪比3∶1為檢出限，信噪比10∶1為定量限計算其檢測限，結果見表2。

表1 各嘌呤的標準曲線

表2 嘌呤的精密度及檢測限

2.4 加標回收率

向已知嘌呤含量的黃酒樣品中加入一定量的嘌呤標準品，進行加標回收率實驗，結果見表3。

2.5 黃酒中4種游離嘌呤的測定結果

對市售某品牌黃酒中的游離嘌呤進行測定，采用保留時間與光譜圖定性，外標法定量。測得游離鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤分別為1.29mg/L、2.93mg/L、3.92mg/L和4.30mg/L。

3 結論

反相高效液相色譜法同時測定黃酒中4種游離嘌呤的條件為：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，柱溫25℃，進樣量20μL，0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液（pH4.0）為流動相，流速1.0 m L/m in，檢測波長254 nm。4種嘌呤的標準曲線呈良好的線性關系，相關系數R2大于0.9990，檢出限在0.02～0.17mg/L。鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤以該方法測定時的精密度分別為0.8%、0.6%、1.4%和1.5%，加標回收率分別為89.9%，105%、92.1%和94.1%，符合分析檢測試驗的要求。通過該方法測得市售某品牌黃酒中游離鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤分別為1.29mg/L、2.93mg/L、3.92mg/L和4.30mg/L。

[1]張昌穎.核酸生物化學[M].北京：人民衛生出版社,1993：307-330.

[2]FUKUUCHIT,YAMAOKAN,KANEKO K.Analysisof intra-and extracellular levelsof purinebases, nucleosides,and nucleotides in HepG2Cellsby highperformance liquid chromatography[J].Analytical sciences,2015,31(9)：895-901.

[3]陳偉,方衛綱,顧蘋,等.富嘌呤食物攝入及肥胖、飲酒等因素與高尿酸血癥的相關性[J].中國臨床營養雜志,2007, 15(2)：70-74.

[4]王海容,付大友.啤酒中嘌呤類物質測定方法的研究進展[J].釀酒科技,2009(6)：95-98.

[5]FUKUUCHIT,YASUDAM,INAZAWAK,etal.A simple HPLCmethod for determining the purine content of beerand beer-like alcoholic beverages[J].Analytical sciences,2013,29(5)：511-517.

[6]呂兵兵,張進杰,儲銀,等.反相高效液相色譜法檢測帶魚糜中的嘌呤含量[J].中國食品學報,2012,12(7)：192-198.

[7]王海容,王蓉,付大友,等.啤酒中嘌呤類物質的測定研究[J].釀酒科技,2008(10)：107-110.

[8]凌云,王新宴,雍煒,等.高效液相色譜法檢測肉類食品中4種嘌呤堿[J].分析化學,2008,36(6)：724-728.

SimultaneousDeterm ination of Four Free Purines in Yellow RiceW ine by Reversed Phase HPLC

LIU Zhen,WANG Lingzhi,ZHANG Shanshan,GELeyong,ZHUGEQing and ZENGHongyan
(NationalQuality Supervision&Testing Center for Yellow RiceWine,Shaoxing Instituteof Food and Drug Testing,Shaoxing,Zhejiang 312000,China)

A simplemethod for simultaneous determination of four free purines in yellow ricew ine by RP-HPLC had been developed. Within the range of 0.5mg/L to 20mg/L,the response of each purine showed a good linear relationship w ith its correlation coefficient R above 0.9990,RSD w ithin 0.8%to 1.5%,detection lim its between 0.02mg/L to 0.17mg/L,and the recoveries between 89%to 105%.The determ ination results suggested that the contentof free adenine,guanine,hypoxanthine and xanthine in yellow rice w ine were4.30mg/L,1.29mg/L,2.93mg/L and 3.92mg/L respectively.

purine;yellow ricew ine;high performance liquid chromatography

TS262.4；TS261.7

A

1001-9286（2017）04-0100-03

10.13746/j.njkj.2016347

2016-11-23

劉鎮(1986-)，女，工程師，博士，主要從事食品檢測。

優先數字出版時間：2017-01-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170125.0851.008.htm l。