社區兒童沙眼衣原體、解脲脲原體檢測分析

吳永平

骨髓增殖性腫瘤（MPNs）包括真性紅細胞增多癥（PV）、原發性血小板增多癥（ET）、慢性粒細胞白血?。–ML）以及原發性骨髓纖維化（PMF）、慢性中性粒細胞白血病（CNL）、肥大細胞疾病（MCD）、慢性嗜酸粒細胞白血?。–EL）和不能分類的MPNs。

JAK2介導包括紅細胞生成素（EPO ）、血小板生成素（TPO ）、粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF ）、生長因子（GH） 、白細胞介素3 （ IL-3 ）在內的多種細胞因子的信號轉導，并通過JAK2-STAT途徑促進或者調節細胞的增殖。研究發現JAK2V617F突變在多種惡性血液病中都有發現，本課題通過合成的JAK2V617F特異性引物，用PCR以及基因測序等方法檢測其突變，對進一步闡明其引發的廣譜的血液病提供臨床診斷及治療依據。

1 方法：

1.1 病例收集：收集我院住院確診的相關患者，共46例。其中PV組8例；ET組12例；CML組4例；PMF組2例；CNL組6例；CEL組2例；嗜堿性粒細胞增多癥（basophilia）組1例；AML組3例；ALL組8例；10例健康志愿者對照。各型白血病診斷標準均參照WHO制定的最新相關標準，其中PV，ET和PMF診斷標準[1]

1.2 儀器與試劑：定性PCR擴增儀：美國Bio-Rad公司Thermal Cycler C1000型。電泳儀：美國Bio-Rad公司 Basic型。凝膠成像分析系統：美國UVP公司EC3 Chemi HR 410 Imaging System。測序儀：美國ABI公司3500。DNA Marker、2×Taq PCR MarkerMix、血液基因組提取試劑盒購自南京凱杰基因。

1.3 引物序列如下，上海invitrogen合成：

F1：5′-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3′；

F2：5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3′；

R：5′-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3′。

1.4 抽取患者和正常對照外周血（骨髓）2mL，提取基因組DNA，采用等位基因特異性PCR（AS-PCR），取5μLPCR產物經20g/L瓊脂糖凝膠電泳后用美國UVP公司EC3凝膠成像分析系統分析圖像、攝像并保存結果。

2 結果

2.1 陰性、陽性的判斷

JAK2V617F基因突變PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果出現364bp和243bp2條條帶者為陽性，出現364bp一條條帶者為陰性。如圖3。

2.2 PV組陽性率為87.5%（7/8），ET組陽性率為33.3%（4/12），PMF組陽性率為50%（1/2） ，AML、ALL、CML、CNL、CEL等惡性血液病患者及正常對照均為陰性。

2.3 JAK2V617F基因突變在PV、ET、PMF患者中的陽性率有顯著性差異（X2=6.239，P值=0.044 <0.05）。

3 討論

James等[1]首先報道了在PV患者中發現JAK2V617F點突變，而其后在其他MPNs亞型中也相繼發現了該基因突變的存在，但其陽性率高低不一。

本實驗研究亦發現，JAK2V617F點突變在PV疾病中陽性率最高，而后是PMF、ET疾病，而在CML、AML、ALL疾病中為陰性，與國際上的報道相符[2]。本實驗中ET患者中JAK2V617F的基因突變與血紅蛋白含量、血小板數量無關，但國外有報道ET患者中JAK2V617F點突變陽性者血紅蛋白量較高、血小板計數較低，故本實驗還有待增加病例總數以便作進一步分析。PV患者陰性例數較少，故未做比較。PV以及ET陽性患者的白細胞計數高于陰性患者，國外研究亦發現陽性患者中白細胞計數高，且可以作為獨立的危險因素與血栓形成及骨髓纖維化成正相關。

參考文獻

[1]James C，U go V，Couedic JPL，et al.A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signaling causes polycythaemia vera[J].N ature，2005，434（7037）：1144～1148.

[2]Kannim S，Thongnoppakhun W，Auewarakul CU.Two-round allele specific-polymerase chain reaction：a simple and highly sensitive method for JAK2-V617F mutation detection[J].Clin Chim Acta，2009，401（1～2）：148～151.