利用geNorm、NormFinder和 BestKeeper軟件進行內參基因穩定性分析的方法

吳建陽+何冰+杜玉潔++李偉才+魏永贊

摘要 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）由于具備靈敏度高、重復性好、特異性強及高通量等優點，已經成為研究基因表達分析的常用方法，但其結果的準確性取決于內參基因。在任何試驗條件下都能穩定表達的內參基因幾乎不存在，科研工作者為了獲得精準的試驗結果，首先必須從眾多的內參基因中篩選出穩定的內參基因。geNorm、NormFinder和BestKeeper等是專門用于篩選穩定性內參基因的軟件，但這3種軟件使用方法差異很大，為了讓更多的科研人員了解這些軟件、節省時間，筆者結合自己的科研經驗詳細介紹了這3種軟件的使用方法，以期為相關科研人員利用這些軟件篩選內參基因提供便利。

關鍵詞 內參基因；穩定性分析；geNorm；NormFinder；BestKeeper

中圖分類號 S60 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）05-0278-04

Abstract Real-time fluorescent quantitative PCR technology（RT-qPCR） is used for gene expression analysis with high sensitivity，good repea-tability，strong specificity，high throughput，but the veracity and reliability results depend on whether select appropriate reference gene or not.However，no universally applicable reference genes with an invariant expression are available.In order to obtain accurate results，appropriate reference genes for RT-qPCR normalisation must systematically evaluate the stability of candidate reference genes prior to using in each experimental system.geNorm，NormFinder and BestKeeper are useful programs to identify appropriate reference genes for RT-qPCR analysis，but the methods for using the three softwares were different.In order to save the time to understanding the way to use them and provide convenient for new researchers，this study described the methods of application.

Key words reference gene；stability analysis；geNorm；NormFinder；BestKeeper

實時熒光定量PCR（RT-qPCR）由于具備靈敏度高、重復性好、特異性強及高通量等優點，已經成為研究基因表達分析的常用方法[1-2]。實時熒光定量PCR分為絕對定量和相對定量，在進行相對定量分析時不需要已知量的標準品，因而該方法被經常運用，但該方法需要用內參基因對目的基因進行數據校正，才能獲得精確的結果[3-4]。

肌動蛋白基因（ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPD

H）、18S rRNA、轉錄延伸因子基因（EF-1α）、多聚泛素酶基因（UBQ）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）等看家基因在之前的研究中常常被當作內參基因進行使用[5-8]。然而，越來越多的研究表明，在某種試驗穩定表達的內參基因，在另一種試驗中有可能是變化的[9-11]，而在任何試驗條件下都能穩定表達的內參基因幾乎不存在[12-13]。如果僅僅根據文獻報道使用某個常用的內參基因，不僅可能導致試驗結果的不準確性，甚至可能導致結論的錯誤。因此，本著嚴謹的科學態度，科研工作者首先必須從眾多的內參基因中篩選出在各自試驗條件下較為穩定的內參基因。

geNorm、NormFinder 和 BestKeeper是專門用于篩選內參基因穩定性的軟件，但這3種軟件的使用方法和分析的側重點各不一樣，為了讓相關科研人員快速了解并掌握這3種軟件的使用方法，筆者結合自身使用這些軟件的經歷，詳細介紹了這3種軟件的使用要點，以期為相關科研人員分析內參基因穩定性提供便利。

1 geNorm軟件

1.1 軟件概述

geNorm 軟件是Vandesompele等[14]在2002年編寫的專門用于實時熒光定量PCR中篩選內參基因及確定最適內參基因數目的程序，該程序可以用于篩選任何試驗的任意數目的內參基因，并最終挑選出2個或2個以上的內參基因組合來校正數據，可使相對定量的結果更為精確。geNorm程序通過計算出每個內參基因穩定性的M值來篩選出穩定性較好的內參基因，判定標準為M值越小內參基因穩定性越好，反之，則穩定性越差。該軟件還可計算引入1個新的內參基因后標準化因子的配對變異V值，并根據Vn/Vn+1值來確定所需最適內參基因的數目。默認的V值為0.15（該值可以人為稍作調整），如果Vn/Vn+1值<0.15，則最適內參基因的數量是n個；而如果Vn/Vn+1值>0.15，則最適內參基因的數量是n+1個。

1.2 操作流程

1.2.1 修改Excel表格安全性級別。若geNorm軟件打開后不能正常運行時，可能是由于Excel表格默認宏的安全性級別設置的比較高，這時需要將Excel表格安全性級別更改到最低級別。更改方法為點擊Excel表格中的“工具”按鈕，然后點擊其下拉菜單“宏”的子菜單“安全性”選項，在彈出來的“安全性”對話框中將安全級別設置為最低。

1.2.2 計算？駐Ct值。先找到該基因在所有樣品中最小的Ct（Cycle threshold）值（表達量最高），再用其他樣品的Ct值減去最低Ct值，從而得到？駐Ct值，該值≥0。

1.2.3 計算2-？駐Ct值。獲得每個樣品每個基因的？駐Ct值后，利用Excel中的函數計算出相應樣品相應基因的2-？駐Ct值，該值就是每個候選內參基因的相對定量數據，也是進行geNorm軟件分析時要用到的數據。

1.2.4 制作Excel表格。在利用geNorm軟件分析時是將已經處理好的各個候選內參基因的相對定量數據保存在一個新的Excel表格中，再把Excel表格導入geNorm程序中。而這個Excel表格中對于基因和樣品的排列位置是有特定要求的，要求規定第一列為試驗的樣品（樣品數量至少在2個以上，樣品數量越多結論越可靠），第1行為欲篩選的內參基因，第1列第1行的單元格必須是空的，其他單元格的數據是在步驟1.2.3中計算得到的基因相對表達量的數值。

1.2.5 內參基因穩定性和合適內參基因數目的確定。關閉所有Excel程序，啟動geNorm程序，點擊菜單欄中的“Load input data”按鈕導入已經在步驟1.2.4中制作的Excel表格，點擊軟件中的“Calculate”按鈕，軟件初步計算后再點擊“Automated analysis”按鈕，便可得到候選內參基因穩定性折線圖，見圖1（a），該圖最左邊基因的M值最高，是穩定性最差的基因（H3基因），右邊基因的M值依次較左邊基因的M值低，穩定性依次增強，最右邊基因的M值最低，是穩定性最好的2個基因（CYP1和Fe-SOD2基因）。點擊菜單欄中的“Print or Save report”按鈕，從彈出來的對話框中選中“save output to fi”選項便可把每個候選內參基因的M值導出到一個Excel中。再次點擊“Automated analysis”按鈕便可得到最適數據歸一化內參數目的柱形圖，見圖1（b），可根據每個柱形圖上面的V值來確定試驗所需的最適內參基因數目，判定標準為當Vn/Vn+1< 0.15時，則最合適內參基因的數量是n個；而如果Vn/Vn+1 > 0.15時，則最合適內參基因的數量是n+1個，所以該試驗條件下的最適內參基因數目是2個，因為V2/3=0.135<0.15。再次點擊菜單欄中的“Print or Save report”按鈕，從彈出來的對話框中選中“save output to fi”選項便可把所有的Vn/Vn+1值導出到一個Excel中。

2 NormFinder軟件

2.1 軟件概述

NormFinder是Claus等[15]在2004年編寫的用于篩選穩定性內參基因的另一種程序，該程序計算原理與geNorm 程序相似，也是先獲得內參基因表達穩定值，再根據穩定值大小來篩選出最合適的內參基因，判定標準為表達穩定值最小的內參基因為最合適的內參基因。NormFinder程序不但可以比較候選內參基因的表達差異，還可以計算樣品組間的變異，但該程序只能篩選出一個最合適的內參基因[16]。

2.2 操作流程

2.2.1 在Excel表格中插入NormFinder軟件。先打開一個Office 2003版的Excel表格，在菜單欄中單擊“工具”下拉菜單中的“加載宏”選項，通過“加載宏”對話框中的“瀏覽”按鈕找到NormFinder軟件存放的位置，點擊“確定”按鈕，將NormFinder軟件功能加載到Excel中，加載成功后在Excel菜單欄中會多一個NormFinder按鈕（圖2）。

2.2.2 計算？駐Ct值。計算方法與步驟1.2.2一致。

2.2.3 計算2-？駐Ct值。計算方法與步驟1.2.3一致。

2.2.4 制作Excel表格。進行NormFinder分析是在Excel表格中進行的，但Excel表格中基因和樣品的排列位置與進行geNorm軟件分析時有所不同。利用NormFinder分析時，Excel表格中第1列為欲篩選的內參基因，第1行為試驗中的樣品，第1列第1行的單元格必須是空的，其他單元格的數據是步驟2.2.3中計算得到的基因相對表達量的數值。

2.2.5 內參基因穩定性的確定。步驟2.2.4處理好后單擊Excel菜單欄“NormFinder”按鈕下拉菜單的“NormFinder”選項，便彈出對話框，如圖3所示。單擊“Select input date”后面的按鈕，就可以利用鼠標在Excel表格中選定數據區域，選定區域后再次回到圖3界面，然后單擊“Go”按鈕，便可獲得各個基因穩定性M值，同時穩定性最好的基因（Best gene）會單獨顯示出來，如圖4所示最穩定的基因為RPL2。

3 BestKeeper軟件

3.1 軟件概述

BestKeeper是Michael等[17]編寫的針對內參基因和目標基因表達量分析的程序，該程序最多只能比較100個樣品中10個內參基因和10個目標基因的表達水平。通過該程序計算可以獲得每個基因之間產生配對的相關系數（r）、標準偏差（SD）和變異系數（CV），再通過比較各個值的大小，最終確定穩定性較好的內參基因。判定原則為相關系數越大、標準偏差和變異系數越小，內參基因穩定性越好，反之，穩定性越差；當SD>1時，則該內參基因表達不穩定。該程序不但可以用于內參基因穩定性比較，還可以分析目的基因的表達水平。

3.2 操作流程

BestKeeper程序是一個內置公式的Excel表格，在該表格中只有CP（crossing point）值輸入區域（CP date input）可以進行數據的輸入和修改，其他區域的單元格由于帶有內置公式而不能進行任何操作。該程序操作較簡單，只需要將實時熒光定量PCR所獲得的CP值直接輸入“CP date input”區域，輸入的CP值是RT-qPCR中3次技術重復所得值的幾何平均數。當CP值輸入完畢后，BestKeeper程序會自動將計算好的相關系數（r）、標準偏差（SD）和變異系數（CV）等值顯示在表格的下方。之后根據判定原則，確定較穩定的內參基因。

4 結語

geNorm、NormFinder和BestKeeper等軟件是專門用于篩選內參基因穩定性的程序，且在多種植物中利用這些軟件獲得的內參基因穩定性試驗成果已在較高檔次的SCI期刊上發表，如在大豆[18]、馬鈴薯[19]、印加果[20]、香蕉[21]上的試驗結果分別在BMC Molecular Biology、Journal of Experimental Botany、International Journal of Molecular Sciences、Planta期刊上發表，筆者利用這些軟件分析獲得的龍眼[22]內參基因穩定性結果也發表在Frontiers in Plant Science期刊。

利用geNorm和NormFinder軟件分析時，需要將RT-qPCR所得到的Ct值轉化為基因的相對表達量，然后按相應的格式把這些數據保存在Excel表格中，而在使用BestKeeper軟件時不需要將RT-qPCR所得到的CP值進行轉化，可以直接使用所得到的CP值。

geNorm分析時首先是將已經處理好的數據保存在Excel表格中，再把Excel表格導入geNorm程序中。NormF-inder分析時是在Excel表格中將NormFinder程序以宏的方式插入到Excel表格中，從而使Excel具有NormFinder分析功能。BestKeeper分析時是在內置BestKeeper公式的Excel表格中直接輸入CP值進行分析。

這3種軟件各具優點，geNorm軟件可以用于篩選任何樣品的任意數量內參基因，通過該程序分析可以篩選出合適的內參基因以及確定最適內參基因數目。NormFinder軟件不但可以比較內參基因的表達差異，還可以計算樣品組間的變異，但只能篩選出1個合適的內參基因。BestKeeper軟件可以用于比較100個樣品中10個內參基因和10個目標基因的表達水平，并最終獲得較為穩定的內參基因。

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