烏司他丁對矽肺大鼠肺組織病理狀態與水通道蛋白1及基質金屬蛋白酶表達的影響

盧乙眾，李合華，盧奕帆（.新鄉醫學院第一附屬醫院藥學部，河南衛輝 45300；.新鄉醫學院第一附屬醫院神經內科，河南衛輝 45300）

烏司他丁對矽肺大鼠肺組織病理狀態與水通道蛋白1及基質金屬蛋白酶表達的影響

盧乙眾1＊，李合華2，盧奕帆1（1.新鄉醫學院第一附屬醫院藥學部，河南衛輝 453100；2.新鄉醫學院第一附屬醫院神經內科，河南衛輝 453100）

目的：研究烏司他丁對矽肺大鼠肺組織病理狀態與水通道蛋白1（AQP-1）及基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9表達的影響。方法：取Wistar大鼠分為正常對照組、模型組和烏司他丁高、中、低劑量組（50×104、10×104、2×104u/kg），每組20只。除正常對照組外，其余各組大鼠采用非暴露式氣管內注入法灌注40 mg/mL的SiO2混懸液1 mL建立矽肺模型；建模給藥前1 h ip相應劑量的烏司他丁，連續給藥3 d。采用蘇木精-伊紅染色觀察各組大鼠肺組織矽結節病理情況；免疫熒光法檢測肺組織中AQP-1的表達；實時熒光定量聚合酶鏈式反應法檢測肺組織中MMP-2、MMP-9 mRNA的表達；Western blot法檢測肺組織中MMP-2、MMP-9蛋白的表達。結果：模型組大鼠肺組織可見明顯矽結節出現，肺組織結構破壞嚴重；烏司他丁各劑量組大鼠可見含塵巨噬細胞灶，但肺纖維化程度較模型組明顯減輕。與正常對照組比較，其余各組大鼠肺組織中AQP-1表達均降低，MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表達均增強（P＜0.05）；與模型組比較，烏司他丁各劑量組大鼠肺組織中AQP-1表達均增加，MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表達均減弱（P＜0.05），其中高、中劑量組改善效果較低劑量組明顯（P＜0.05）。結論：烏司他丁能緩解矽肺模型大鼠病理狀態，可上調肺組織中AQP-1表達和下調MMP-2、MMP-9表達。

烏司他丁；矽肺；大鼠；水通道蛋白1；基質金屬蛋白酶

矽肺是因長期吸入二氧化硅（SiO2）粉塵所引起的以肺組織彌漫性纖維化為主要特征的全身性疾病，其發病機制尚未明確。目前在我國接觸矽塵的人數、新增矽肺患者數及現患矽肺病例數均居世界第一，已嚴重危害到人們的生命健康，成為我國最嚴重的職業病之一[1-2]。臨床治療經驗表明，矽肺病變特點主要為肺內矽結節形成及肺間質的廣泛纖維化。在這復雜的病變形成過程中，一些細胞因子或蛋白，如水通道蛋白1（AQP-1）及基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9在矽肺纖維化的發生發展中發揮了關鍵作用，MMP-2及MMP-9基因與蛋白的表達變化可能與矽肺纖維化密切相關[3-4]。本文旨在研究烏司他丁對矽肺模型大鼠肺組織AQP-1及MMP-2、MMP-9表達的影響及意義，探討烏司他丁對矽肺的治療作用。

1 材料

1.1 儀器

XP-202E電子顯微鏡（上海美軒生物科技有限公司）；DM6000M倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 藥品與試劑

烏司他丁注射液（廣東天普生化醫藥股份有限公司產，批號：H19990133，規格：每支105U）；水合氯醛（鄭州優然食品配料有限公司）；SiO2（上海晟浦信息科技發展有限公司）；胎牛血清（FBS，美國Couler公司）；25%胰蛋白酶（美國Gibco公司）；DMEM/F12（美國Sigma公司）；實時定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、蛋白免疫印跡（Western blot）試劑盒（美國Hyclone公司）；兔抗人AQP-1、MMP-2、MMP-9多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；生物素化抗兔免疫球蛋白G（IgG）、Cy2標記鏈霉親和素（上海鈺森生物技術有限公司）；羊抗兔IgG抗體（上海研生實業有限公司）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，上海魯汶生物科技有限公司）；蘇木精-伊紅（HE，上海銳賽開展生物技術有限公司）。

1.3 動物

Wistar大鼠，1月齡，♂，體質量為212～230 g，采購于河南醫科大學動物實驗室，動物許可證號為SCXK（豫）2010-1-0002。實驗中對大鼠的處置方法符合動物倫理學要求。

2 方法

2.1 大鼠矽肺模型的建立

取大鼠，用3.5%的水合氯醛麻醉后固定，采用非暴露式氣管內注入法將SiO2混懸液1 mL（以生理鹽水制成40 mg/mL的混懸液，滅菌后加青霉素2 000 u/mL，以防止肺部感染）緩慢注入氣管。于灌注后第14天處死3只大鼠，取大鼠右肺，肉眼觀察和手指觸摸有異常的肺組織，用10%中性緩沖福爾馬林液固定，脫水后常規石蠟包埋。

2.2 分組與給藥

實驗分為正常對照組、模型組和烏司他丁高、中、低劑量組（50×104、10×104、2×104u/kg）[5-6]，每組20只。正常對照組大鼠注入等量的滅菌生理鹽水（臨用前加青霉素2 000 u/mL）；其余各組大鼠灌注SiO2混懸液1 mL，烏司他丁各劑量組大鼠于灌注SiO2混懸液后，ip相應劑量的烏司他丁，均連續給藥3 d。

2.3 HE染色觀察肺組織病理學變化

末次給藥后處死大鼠，固定，取右肺組織，置于10%中性福爾馬林中固定24 h后依次進行常規梯度乙醇（100%乙醇-95%乙醇-80%乙醇）脫水，自來水沖洗；蘇木精染色5～10 min，自來水沖洗；在0.5%的鹽酸乙醇溶液中分化1～2 s，溫水浸泡沖洗；置于伊紅中染色30 s，自來水沖洗；分別在95%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇中依次脫水，透明，切片烘干，封片，置于光鏡下觀察肺組織病理學變化。

2.4 免疫熒光法檢測肺組織中AQP-1表達

將大鼠肺組織切片放入兔抗人AQP-1多克隆抗體（稀釋比例1∶500）中，4℃下孵育過夜后，放入生物素化抗兔IgG、Cy2標記鏈霉親和素混合液中，室溫孵育1 h，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3遍，固定，以DAPI對細胞核進行染色。DAPI本身呈藍色，DAPI陽性表達（即AQP-1表達）呈綠色。采用倒置熒光顯微鏡進行觀察，并計算DAPI陽性率（陽性率＝DAPI陽性細胞數/全部細胞數×100%）。

2.5 RT-PCR檢測肺組織中MMP-2、MMP-9 mRNA表達

分離肺泡壁單個核細胞后在4℃下2 000×g離心20 min，棄上清液，PBS沖洗3次，通過Trizol法提取總RNA。根據PCR試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDRA。引物由Gene Bank基因公司合成，序列設計：MMP-2上游引物為5′ -GGTGAGAGGTCTAGTTCCCGA-3′，下游引物為5′ -CCATGAACTTTCTGCTCTTC-3′，擴增片段為327 bp；MMP-9上游引物為5′ -TGTATGGTCGTGGCTCAA-3′，下游引物為5′ -TTGGCTTCCT-CCGTGATT-3′，擴增片段為329 bp；內參β-actin上游引物為5′ -GTCCCTCACCCTCCCAAAAG-3′，下游引物為5′ -GCTGCCTCAACACCTCAACCC-3′，擴增片段為185 bp。PCR反應條件：95℃變性3 min，94℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環40周期，72℃延伸7 min。產物于4℃保存，試驗重復3次。取5 mL的PCR產物進行電泳，以β-actin為內參，采用Image-Pro Plus 8.0軟件分析條帶灰度值，以目標條帶與內參條帶的灰度值的比值作為目標基因的相對表達量。

2.6 Western blot檢測肺組織中MMP-2、MMP-9蛋白表達

將“2.5”項下提取殘留物通過1 500 r/min（離心半徑10 cm）離心30 min，取上清為粗體蛋白，總蛋白質濃度通過考馬斯亮蘭法（Bradford法）測定。將膜浸沒在Western blot封閉液Ⅱ（TBST溶解的5%脫脂奶粉，pH 7.5）中，在室溫下輕搖30 min。用Western blot封閉液Ⅱ稀釋兔抗人MMP-2、MMP-9多克隆抗體（稀釋比例1∶2 000），室溫下孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，加入羊抗兔IgG抗體（稀釋比例1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次。膜用1 mL增強化學發光（ECL）試劑反應3 min，曝光1 min，顯影2 min，定影。用Quantity One圖像分析MMP-2、MMP-9與相應內參β-actin條帶吸光度的比值，作為目標蛋白的相對表達量。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 大鼠肺組織病理學變化

與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織可見明顯矽結節出現，矽結節內有碳末沉積，周邊部纖維母細胞增生，肺組織層狀纖維化伴透明樣變化；烏司他丁高、中、低劑量組大鼠可見含塵巨噬細胞灶。與模型組比較，烏司他丁高、中、低劑量組大鼠的肺纖維化程度明顯減輕，其中烏司他丁高、中劑量組減輕程度較烏司他丁低劑量組明顯。各組大鼠肺組織的病理學變化圖見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織的病理學變化圖（HE，×400）Fig 1 Pathological changes in lung tissue of rats in each group（HE，×400）

3.2 大鼠肺組織中AQP-1表達

正常對照組、模型組和烏司他丁高、中、低劑量組大鼠肺組織中AQP-1的表達量分別為4.64±0.16、1.63± 0.10、3.47±0.14、3.39±0.12、2.15±0.13。與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織中AQP-1表達降低（P＜0.05）。與模型組比較，烏司他丁高、中、低劑量組大鼠肺組織中AQP-1表達增強（P＜0.05），其中烏司他丁高、中劑量組減輕程度較烏司他丁低劑量組明顯（P＜0.05）。各組大鼠肺組織中AQP-1表達的熒光圖見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織中AQP-1表達的熒光圖（×400）Fig 2 Fluorescence diagram of AQP-1 expression in lung tissue of rats in each group（×400）

3.3 大鼠肺組織中MMP-2、MMP-9 mRNA與蛋白表達

與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織中MMP-2、MMP-9 mRNA與蛋白表達均增強（P＜0.05）。與模型組比較，烏司他丁高、中、低劑量組大鼠肺組織中MMP-2、MMP-9 mRNA與蛋白表達均減弱（P＜0.05），其中烏司他丁高、中劑量組表達減弱程度較烏司他丁低劑量組明顯（P＜0.05）。各組大鼠肺組織中MMP-2、MMP-9 mRNA表達的電泳圖見圖3，蛋白表達電泳圖見圖4，測定結果見表1。

圖3 各組大鼠肺組織中MMP-2、MMP-9 mRNA表達的電泳圖Fig 3 Electrophoresis chart of MMP-2，MMP-9 mRNA expressions in lung tissue of rats in each group

圖4 各組大鼠肺組織中MMP-2、MMP-9蛋白表達的電泳圖Fig 4 Electrophoresis chart of MMP-2，MMP-9 protein expressions in lung tissue of rats in each group

表1 各組大鼠肺組織中MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表達的測定結果（s，n＝20）Tab 1 Determination results of MMP-2，MMP-9 mRNA and protein expressions in lung tissue of rats in each group（s，n＝20）

表1 各組大鼠肺組織中MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表達的測定結果（s，n＝20）Tab 1 Determination results of MMP-2，MMP-9 mRNA and protein expressions in lung tissue of rats in each group（s，n＝20）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與烏司他丁低劑量組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.ulinastatin low-dose group，ΔP＜0.05

蛋白0.72±0.10 2.05±0.11＊1.01±0.12#Δ1.04±0.13#Δ1.42±0.14#組別正常對照組模型組烏司他丁高劑量組烏司他丁中劑量組烏司他丁低劑量組MMP-2 mRNA 0.34±0.07 1.47±0.10＊0.54±0.11#Δ0.56±0.12#Δ0.72±0.10#蛋白0.53±0.14 1.91±0.12＊0.92±0.12#Δ0.95±0.13#Δ1.34±0.11#MMP-9 mRNA 0.61±0.13 1.63±0.12＊0.64±0.14#Δ0.65±0.10#Δ0.96±0.12#

4 討論

他汀類藥物是一種廣譜蛋白酶抑制劑，主要用于控制血液中膽固醇的含量以及預防心血管疾病。烏司他丁是羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，分子量為67 000 D的糖蛋白，可抑制胰蛋白酶、透明質酸酶等的活性，能通過阻止炎癥細胞聚集、抑制炎癥介質的過度釋放、清除氧自由基，起到減輕創傷、休克、多器官功能不全時器官組織的進一步損害及改善微循環和組織灌注等藥理作用。已有多項研究表明烏司他丁在肺纖維化發病過程中發揮著重要的作用[7-8]。

AQP-1是與水通透性有關的細胞膜轉運蛋白，廣泛分布于哺乳動物和植物細胞膜上。AQP-1在多種器官的生理和病理中發揮著重要作用，其主要功能是介導自由水被動跨生物膜轉運，對保持細胞內外環境的穩態平衡起重要作用。研究發現，肺組織AQP-1表達下降可能造成肺泡內水分清除下降、肺部水代謝失衡，導致炎癥水腫的進一步發生、發展[9]。

本研究結果表明，烏司他丁可緩解矽肺大鼠肺組織病理狀態，上調肺組織中AQP-1表達和下調MMP-2、MMP-9表達。

[1] Li Y，Li SY，Li JS，et al.A rat model for stable chronic obstructive pulmonary disease induced by cigarette smoke inhalation and repetitive bacterial infection[J].Biol Pharm Bull，2012，35（10）：1752-1760.

[2] Wright JL，Cosio M，Churg A.Animal models of chronic obstructive pulmonary disease[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，295（1）：1-15.

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（編輯：鄒麗娟）

Effects of Ulinastatin on Pathological State of Lung Tissue and Aquaporin 1 and Matrix Metalloproteinase Expressions in Silicosis Rats

LU Yizhong1，LI Hehua2，LU Yifan1（1.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University，Henan Weihui 453100，China；2.Dept.of Neurology，the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University，Henan Weihui 453100，China）

OBJECTIVE：To study the effects of ulinastatin on pathological state of lung tissue and aquaporin 1（AQP-1）and matrix metalloproteinases（MMP-2），MMP-9 expressions in silicosis rats.METHODS：Wistar rats were divided into normal control group，model group，ulinastatin high-dose，medium-dose，low-dose groups（50×104，10×104，2×104u/kg），20 in each group. Except for normal control group，rats in other groups were given 40 mg/mL SiO2suspension 1 mL by non-exposed endotracheal perfusion to induce silicosis model；1 h before modeling administration，corresponding doses of ulinastatin were intraperitoneally injected，for 3 d.Hematoxylin-eosin staining was used to observe silicon nodules in lung tissue of rats in each group；immunofluorescence method was used to detect AQP-1 expression in lung tissue；real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction method was used to detect MMP-2，MMP-9 mRNA expressions in lung tissue；Western blot method was used to detect MMP-2，MMP-9 protein expressions in lung tissue.RESULTS：There were obvious silicon nodules and serious structural damage in lung tissue in model group，ulinastatin groups showed macrophage foci visible dust，but pulmonary fibrosis was obviously reduced.Compared with normal control group，AQP-1 expression in lung tissue in other groups were reduced，MMP-2，MMP-9 mRNA and protein expressions were enhanced（P＜0.05）.Compared with model group，AQP-1 expression in lung tissue in ulinastatin groups were increased，MMP-2，MMP-9 mRNA and protein expressions were decreased（P＜0.05），in which improvement effects in highdose，medium-dose groups were superior to low-dose group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Ulinastatin can reduce the pathological state of silicosis rats，increase AQP-1 expression and decrease MMP-2，MMP-9 expressions.

Ulinastatin；Silicosis；Rats；Aquaporin 1；Matrix metalloproteinases

R965

A

1001-0408（2017）10-1350-04

2016-07-18

2016-09-22）

＊副主任藥師。研究方向：藥事管理、臨床藥學。電話：0373-4402847。E-mail：luyizhongxb@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.14