淫羊藿苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腎損傷的改善作用及機(jī)制研究Δ

朱 玲，錢志強(qiáng)，李葉麗，王俊逸，楊 華，楊丹莉#（.遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室/基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563000；.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州遵義 563000）

淫羊藿苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腎損傷的改善作用及機(jī)制研究Δ

朱 玲1＊，錢志強(qiáng)1，李葉麗1，王俊逸1，楊 華2，楊丹莉1#（1.遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室/基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州遵義 563000）

目的：觀察淫羊藿苷（ICA）對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）腎組織病理?yè)p傷的影響，并基于核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路研究其作用機(jī)制。方法：將21只SHR隨機(jī)均分為模型組和ICA低、高劑量組（20、40 mg/kg，記為ICA-L、ICA-H組），另取7只同源京都大鼠（WKY）為對(duì)照組。各組大鼠ig給藥，每日2次，連用11周；對(duì)照組和模型組大鼠ig等體積雙蒸水。觀察各組大鼠腎組織病理學(xué)變化；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)腎組織磷酸化NF-κB-p65（p-NF-κB-p65）、NF-κB抑制蛋白（IκB）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，腎小球囊腔狹窄且不規(guī)則；IκB蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，ICA-L、ICA-H組大鼠腎組織上述病理變化有所改善；ICA-L、ICA-H組IκB蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），ICA-H組大鼠p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.01），ICA-L組大鼠p-NF-κB-p65蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），而ICA-L組大鼠TNF-α蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：ICA具有改善SHR腎病理性損傷的作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。

淫羊藿苷；自發(fā)性高血壓大鼠；腎組織；磷酸化核因子κB-p65；腫瘤壞死因子α

近年來，高血壓腎病患者的數(shù)量呈逐年上升趨勢(shì)[1]，其為高血壓的主要并發(fā)癥之一[2]。自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）是目前公認(rèn)的研究原發(fā)性高血壓及其并發(fā)癥的動(dòng)物模型。淫羊藿系小檗科淫羊藿屬植物，為我國(guó)傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效。淫羊藿苷（ICA）是淫羊藿的主要活性成分之一，具有降壓、改善缺血再灌注損傷、增強(qiáng)免疫力等作用[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ICA可降低SHR血壓，改善其左心室重構(gòu)、減輕腎纖維化、對(duì)抗腎小管上皮細(xì)胞凋亡[5-7]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路在高血壓腎損傷的發(fā)生、發(fā)展中起著樞紐作用[8]。因此，在本研究中筆者擬探討ICA對(duì)SHR腎實(shí)質(zhì)損傷的改善作用，并探討這一作用是否與其抑制NF-κB信號(hào)通路的機(jī)制有關(guān)，以期為ICA的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Mastercycler Gradient梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（德國(guó)Eppendorf公司）；Supply Mini-Protean3電泳儀、Trans Blor TurhoMini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、Universal Hood 11 CCD成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；BX43+DP2b Olympus光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

ICA原料藥（南京澤朗醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：FY17420615，純度：≥98%）；磷酸化NF-κB-p65（p-NF-κB-p65）、NF-κB抑制蛋白（IκB）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）兔源多抗（美國(guó)Abcam公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（上海康成生物技術(shù)有限公司）；免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑（ECL，上海七海生物有限公司）；HRP標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）（H+L）二抗（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SHR 21只，♂，14周齡；同源京都大鼠（WKY）7只，♂，體質(zhì)量均為260～300 g，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001]。

2 方法

2.1 分組與給藥

21只SHR隨機(jī)均分為模型組和ICA低、高劑量組（20、40 mg/kg，記為ICA-L、ICA-H組），給藥劑量根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定[5]，低劑量相當(dāng)于人臨床等效劑量的6.3倍[9]；另取7只WKY作為對(duì)照組。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后ig給藥，每日2次，連用11周；對(duì)照組和模型組大鼠ig等體積雙蒸水。

2.2 各組大鼠腎組織病理觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠ip7%水合氯醛（0.53 g/kg）麻醉后處死，取腎組織置于4%甲醛溶液中固定48 h后，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察腎組織病理變化。

2.3 各組大鼠p-NF-κB-p65、IκB、TNF-α蛋白表達(dá)

采用蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法測(cè)定。稱取“2.2”項(xiàng)下大鼠腎組織約0.1 g，剪碎后置于1 mL RIPA裂解液中，加入苯甲基磺酰氟10 μL，冰上勻漿后靜置30 min，4℃離心（離心半徑為9 cm，12 000 r/min）20 min。取上清液，用聚氰基丙烯酸正丁酯法測(cè)定待測(cè)樣品的總蛋白濃度。每孔上樣量為30 μg，蛋白配置為10 μL上樣體系。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，上層為5%濃縮膠，下層為12%分離膠。電泳后采用Bio-Rad Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)聚偏氟乙烯（PVDF）膜轉(zhuǎn)膜，5%蛋白封閉液封閉2.5 h，TBST洗膜10 min×3次，一抗結(jié)合：GAPDH（1∶5 000）、p-NF-κB-p65（1∶500）、IκB（1∶2 000）、TNF-α（1∶2 000），4℃過夜；TBST洗膜，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶2 000），常溫孵育1.5 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，采用Bio-Rad CCD成像系統(tǒng)獲取圖像。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用ONE-WAYANOVA檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnett T3法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠腎組織病理觀察結(jié)果

光鏡觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常；與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎小球囊腔狹窄且不規(guī)則，腎小球系膜基質(zhì)增多，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，細(xì)胞排列紊亂，腎小管上皮細(xì)胞水腫、管腔狹窄；與模型組比較，ICA-L、ICA-H組大鼠腎小球囊腔增寬，部分毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，細(xì)胞排列紊亂有所改善，毛細(xì)血管管腔開放良好，腎小管上皮細(xì)胞水腫減輕，詳見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理觀察結(jié)果（×400）Fig 1 Pathological observation results of kidney tissue of rats in each group（×400）

3.2 各組大鼠p-NF-κB-p65、IκB、TNF-α表達(dá)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組大鼠IκB蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，ICA-L、ICA-H組大鼠IκB蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），ICA-H組p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.01），ICA-L組p-NF-κB-p65蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），而ICA-L組TNF-α蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見圖2、表1。

4 討論

高血壓是心腦血管疾病、腎疾病等的重要危險(xiǎn)因素。高血壓腎病通常是指原發(fā)性高血壓導(dǎo)致的腎小動(dòng)脈或腎實(shí)質(zhì)損害，又稱為高血壓腎硬化癥。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎小球囊腔狹窄且不規(guī)則，腎小球系膜基質(zhì)增多，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，細(xì)胞排列紊亂，腎小管上皮細(xì)胞水腫、管腔狹窄，說明SHR出現(xiàn)了高血壓腎實(shí)質(zhì)損害的病理改變。然而，給予ICA-L、ICA-H后，SHR紊亂的腎結(jié)構(gòu)有所減輕，這與之前報(bào)道ICA具有改善SHR腎病理性損害的結(jié)論[6]相一致。

圖2 各組大鼠p-NF-κB-p65、IκB、TNF-α蛋白表達(dá)電泳圖Fig 2 Electrophoresis chart of protein expressions of p-NF-κB-p65，IκB，TNF-α of rats in each group

表1 各組大鼠p-NF-κB-p65、IκB、TNF-α蛋白表達(dá)水平（s，n＝10）Tab 1 Protein expression levels of p-NF-κB-p65，IκB，TNF-α of rats in each group（s，n＝10）

表1 各組大鼠p-NF-κB-p65、IκB、TNF-α蛋白表達(dá)水平（s，n＝10）Tab 1 Protein expression levels of p-NF-κB-p65，IκB，TNF-α of rats in each group（s，n＝10）

注：與對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01 Note：vs.control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

TNF-α 0.49±0.10 1.17±0.10＊＊1.11±0.12 0.82±0.07##組別對(duì)照組模型組ICA-L組ICA-H組p-NF-κB-p65 0.82±0.17 1.26±0.06＊＊1.12±0.06#0.94±0.10##IκB 1.35±0.22 0.64±0.18＊＊0.95±0.07#1.21±0.08##

靜息狀態(tài)下，NF-κB以p65/p50異源二聚體的形式與其抑制蛋白IκB結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中，無活性。當(dāng)細(xì)胞受到病毒、機(jī)械力、氧化應(yīng)激、炎癥因子等刺激時(shí)，IκB在IκB激酶的作用下發(fā)生磷酸化并降解，NF-κB被激活，磷酸化的p65/p50迅速?gòu)陌麧{轉(zhuǎn)移至胞核，尤其是p65亞型，與DNA鏈上的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)TNF-α、白細(xì)胞介素1β等轉(zhuǎn)錄。在高血壓狀態(tài)下，NF-κB激活可造成腎損害[10]。在本研究中，與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織IκB蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，p-NF-κB-p65水平明顯升高。然而，給予ICA后，SHR的IκB蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，p-NF-κB-p65的水平明顯降低。這提示ICA可能通過抑制NF-κB的激活和IκB降解，從而減輕SHR腎病理性損傷。

TNF-α是NF-κB的下游因子之一[11]，參與了高血壓腎損害的發(fā)生和發(fā)展[12-13]，也是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎癥因子，能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，調(diào)節(jié)其他組織代謝活性并促使其他細(xì)胞因子的合成和釋放。Elmarakby AA等[14]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α阻滯藥可減輕鹽敏感高血壓大鼠的慢性腎損傷。在本研究中，與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織的TNF-α蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而ICA可明顯下調(diào)TNF-α蛋白表達(dá)。這提示ICA可能通過抑制NF-κB信號(hào)，下調(diào)TNF-α蛋白表達(dá)，從而減輕SHR腎病理性損傷。

綜上所述，ICA具有改善SHR腎病理性損傷的作用，其機(jī)制可能與其抑制NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。

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Study on Improvement Effect and Mechanism of Icariin on Renal Lesion in Rats with Spontaneous Hypertension

ZHU Ling1，QIAN Zhiqiang1，LI Yeli1，WANG Junyi1，YANG Hua2，YANG Danli1（1.Teaching and Research Office of Pharmacology/the Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education，Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563000，China；2.Dept.of Pathology，Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563000，China）

OBJECTIVE：To observe the effect of pathological lesion of renal tissue in rats with spontaneous hypertension（SHR），and study its mechanisms based on nuclear factor κB（NF-κB）signaling pathway.METHODS：21 SHR were randomly divided into model group and ICA low-dose，high-dose groups（20，40 mg/kg，denoted by ICA-L，ICA-H groups）；other 7 homologous Kyoto rats（WKY）were regarded as control group.All rats were intragastrically administrated，twice a day，for 11 weeks，rats in control group and model group received equal volume of double distilled water，ig.Pathological changes in renal tissue in each group were observed；Western blot method was used to detect protein expressions of p-NF-κB-p65，IκB and TNF-α in renal tissue.RESULTS：Compared with control group，model group showed disorder renal structure，narrow and irregular glomerular cysts；the protein expression of IκB was significantly down-regulated，protein expressions of p-NF-κB-p65 and TNF-α were significantly up-regulated（P＜0.01）.Compared with model group，the above-mentioned changes of rats showed improvement in ICA-L，ICA-H groups；the protein expression of IκB was significantly up-regulated in ICA-L，ICA-H groups（P＜0.05 or P＜0.01）；the protein expressions of p-NF-κB-p65 and TNF-α were significantly down-regulated（P＜0.01）in ICA-H groups；p-NF-κB-p65 protein expression was significantly down-regulated in ICA-L group（P＜0.05）；while there was no significant difference in TNF-α protein expression in ICA-L group（P＞0.05）.CONCLUSIONS：ICA plays a role in improving renal pathological lesion in SHR，and the mechanism may be related to inhibiting NF-κB signaling pathway.

Icariin；Spontaneously hypertension rats；Renal tissue；p-NF-κB-p65；TNF-α

R965

A

1001-0408（2017）10-1326-03

2016-06-06

2017-02-07）

（編輯：劉明偉）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81241142，81660679）

＊碩士研究生。研究方向：心血管藥理學(xué)、抗炎免疫藥理學(xué)。電話：0851-28643568。E-mail：lingluhappy@foxmail.com

#通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：心血管藥理學(xué)、抗炎免疫藥理學(xué)。電話：0851-28643568。E-mail：zmuyangdanli@foxmail.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.08