哈巴苷在大鼠體內代謝產物的鑒定與分析Δ

劉 震，徐 風，王靜哲，劉廣學，尚明英，蔡少青（北京大學藥學院，北京 100191）

·實驗研究·

哈巴苷在大鼠體內代謝產物的鑒定與分析Δ

劉 震＊，徐 風，王靜哲，劉廣學，尚明英#，蔡少青（北京大學藥學院，北京 100191）

目的：研究玄參活性成分哈巴苷在大鼠體內的代謝產物及其分布、代謝類型和其可能的活性。方法：4只SD大鼠隨機分為空白組（超純水）和給藥組（哈巴苷對照品溶液），每組2只，ig給藥，160 mg/kg，每日2次，連用3 d。于給藥前及首次給藥后每12 h收集各組大鼠尿液和糞便，最后1次給藥后0.5、1 h穿心取血8 mL并取出心、肝、脾、肺、腎、胃和小腸等組織，分別制備血液、尿液、糞便及各組織樣品溶液。采用高效液相色譜-質譜聯用法檢測和鑒定哈巴苷在大鼠體內的代謝產物并推測其代謝途徑，采用Pharm Mapper軟件預測代謝產物活性。結果：從大鼠體內鑒定出哈巴苷代謝產物12種，其原型及代謝產物主要分布在心、肝、脾、肺、腎、胃和小腸中，其代謝類型主要包括水解、脫水、還原、甲基化、硫酸酯化、葡萄糖醛酸結合、一級香豆酸結合等。12種化合物可能具有治療癲癇、肌萎縮側索硬化、糖尿病、腦中風等活性。結論：哈巴苷可能是以原型和代謝產物的形式發揮藥效的。本研究為歸屬玄參體內代謝產物來源、研究玄參顯效形式、闡明玄參藥理作用機制和炮制機制提供了依據。

玄參；哈巴苷；液質聯用；代謝產物；代謝途徑；活性

玄參為我國傳統常用中藥材，為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根，具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結之功效[1]?，F代藥理學研究表明，玄參具有抗炎[2]、免疫調節[3]、神經保護[4]和抗腦缺血等活性[5]。環烯醚萜類化合物為玄參中重要的化學成分類型，其中哈巴苷是玄參主要的環烯醚萜苷類成分之一。大量研究表明，哈巴苷的藥理活性與玄參傳統功效相關，哈巴苷可促進脾淋巴細胞-刀豆蛋白A誘導的增殖反應[6]，具有神經保護作用[7]和抑制血小板凝聚作用[8]。據文獻報道，傳統的產地加工和炮制手段可降低玄參中的哈巴俄苷含量[9]，升高哈巴苷含量[10]。2015年版《中國藥典》（一部）規定玄參中哈巴俄苷和哈巴苷的總含量不得少于0.45%[1]。因此，進行哈巴苷的體內代謝研究有助于闡明其代謝產物及其分布、代謝途徑以及代謝產物可能的活性，揭示其體內存在形式和發揮藥效的機制，為歸屬玄參體內代謝產物來源、闡明藥理作用機制和炮制機制提供依據。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜-離子阱-飛行時間質譜聯用（HPLCESI-IT-TOF-MS）儀，包含2個LC-20AD輸液泵、1個LC-20AB輸液泵、CBM-20A系統控制器、脫氣單元DGU-20A3、可制冷自動進樣器SIL-20AC、柱溫箱CTO-20A、二極管陣列檢測器SPD-M20A、ESI離子源、ESIIT-TOF-MS系統（日本Shimadzu公司）；BP211D十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥材與試劑

哈巴苷對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：15031605，純度：＞98.00%）；甲醇、乙腈均為色譜純；水為超純水。

1.3 動物

清潔級SD大鼠4只，♂，體質量200～250 g，購于北京大學醫學部動物科學部，動物合格證號：SCXK（京）11-00-0006。所有動物實驗均得到北京大學醫學倫理委員會的許可，倫理審查許可證號：LA2015-007。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil 100-5 C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；保護柱：Zorbax SBC18；流動相：純水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序：0～10 min，1%B；10～15 min，1%～2%B；15～20 min，2%～3.5%B；20～25 min，3.5%B；25～35 min，3.5%～6.5%B；35～40 min，6.5%B；40～48 min，6.5%～9%B；48～60 min，9%～11.5%B；60～70 min，11.5%B；70～75 min，11.5%～40.5%B；75～81 min，40.5%B；81～95 min，40.5%～100%B；95～105 min，100%B）；柱溫：35℃；檢測波長：280 nm；進樣量：10 μL；流速：1 mL/min。

2.1.2 質譜條件 檢測范圍：MS1～MS3m/z 100～1 000；離子累積時間：30 ms；N2流速：1.5 L/min；曲型脫溶劑裝置溫度：200℃；檢測壓力：1.7 kV；干燥器電壓：98.0 kV；最大壓力：30 MPa；檢測模式：負離子切換檢測。

2.2 哈巴苷對照品溶液的制備

稱取哈巴苷對照品適量，用超純水溶解，制成質量濃度為40 mg/mL的哈巴苷對照品溶液，備用。

2.3 分組與給藥

4只SD大鼠隨機分為空白組和給藥組（“2.2”項下哈巴苷對照品溶液），每組2只。適應性飼養6 d后，給藥組大鼠ig給藥，160 mg/kg（給藥劑量根據預實驗確定），每日上午9：00、晚21：00各1次，連用3 d；空白組大鼠ig等體積超純水。給藥期間正常喂食、喂水。收集給藥組大鼠給藥前的尿液、糞便，冷藏保存于4℃冰箱，與給藥后進行比較。

2.4 樣品的收集與處理

首次給藥后，每12 h收集1次大鼠尿液和糞便，冷藏保存于4℃冰箱。末次給藥后，分別在給藥0.5、1 h后ip水合氯醛麻醉（380 mg/kg），穿心取血8 mL。取血后迅速取出心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸組織，以生理鹽水灌洗，于－30℃冰箱冷凍保存。

將各組大鼠血液于4℃離心（離心半徑為 20 cm，5 000 r/min）15 min，取上清液，加5倍量甲醇超聲沉淀蛋白，離心（離心半徑為20 cm，10 000 r/min）15 min，取上清液，N2吹至干，加入1/4倍量甲醇復溶，過0.45 μm微孔濾膜，進樣分析。

將各組大鼠尿液樣品濃縮，蒸干。取0.5 g尿液樣品蒸干物，加2 mL 50%甲醇復溶，即得質量濃度為250 mg/mL的尿液樣品溶液，過0.45 μm濾膜，進樣分析。

將各組糞便樣品于50℃烘干，研磨，取7 g研磨粉，用20倍50%甲醇于20℃超聲提取30 min，過濾后濃縮，蒸干。取0.5 g糞便樣品蒸干物，加入2 mL 50%甲醇復溶，即得質量濃度為250 mg/mL的糞便樣品溶液，過0.45 μm濾膜，進樣分析。

取各組大鼠內臟組織，用生理鹽水洗凈血液并去除周圍脂肪組織，稱取相同組織10 g，用50 mL 50%甲醇勻漿3 min，20℃超聲30 min，離心（離心半徑為20 cm，12 000 r/min）15 min，取上清液，減壓濃縮，蒸干。取0.25 g內臟組織蒸干物，加1 mL甲醇復溶，即得質量濃度為250 mg/mL的內臟組織溶液，過0.45 μm濾膜，進樣分析。

2.5 哈巴苷質譜裂解規律

哈巴苷具有4-去甲基環烯醚萜苷的典型結構特征，其HPLC-MS/MS裂解規律見圖1[11]。哈巴苷在負離子模式（NI）下會出現更多質譜離子碎片信息，且在中等強度碰撞電壓（120 V）下，質譜圖中易觀察到[M+HCOO]－的加合離子基峰；較高的碰撞電壓（320 V）下，易出現[MH]－的基峰[10]。本研究以NI信息為主進行哈巴苷及其代謝產物的解析，發現本試驗條件下的準分子離子多為[M-H]－峰，此外還發現了[M+Cl]－峰。哈巴苷典型的裂解方式可概括為丟失葡萄糖與水分子形成m/z 201、183特征性碎片離子；此外，結構中的半縮醛環易開裂形成m/z 157、139特征碎片離子。結合上述哈巴苷質譜裂解數據，筆者在大鼠血液、尿液、糞便和組織中都發現了哈巴苷，其具體裂解信息如下。

圖1 哈巴苷的裂解規律Fig 1 Cracking rule of harpagide

哈巴苷（保留時間為29.925 min），負離子一級質譜中顯示準分子離子峰[M-H]－為m/z 363.131 8，預測分子式為C15H24O10。二級質譜碎片主要有m/z 201.076 3、183.064 6、165.063 6、157.059 2、139.042 3。其中，m/z 201.076 3為[M-H-glucosyl]－，m/z 183.064 6為[M-H-glucosyl-H2O]－，m/z 165.063 6為[M-H-glucosyl-2H2O]－，m/z 157.059 2為[M-H-glucosyl-CH3CHO]－，m/z 139.042 3為[M-H-glucosyl-CH3CHO-H2O]－。

2.6 哈巴苷代謝產物的分析鑒定

采用HPLC-ESI-IT-TOF-MS分析技術對“2.4”項下樣品在NI下進行檢測，結果在NI模式下的基峰色譜（BPC）圖中，發現了血液中代謝產物1種、尿中代謝產物10種、糞便中代謝產物3種。NI模式下各組織的BPC圖見圖2。去除重復代謝產物，共鑒定出代謝產物12種，詳見表1。

圖2 NI模式下各組織的BPC圖Fig 2 Base peak chromatogram of each sample in negative ion mode

12種化合物均屬首次報道，分別為哈巴苷水解形成的哈巴苷苷元（HM1）、哈巴苷水解并與香豆酸結合產物（HM2）、哈巴苷脫水并與葡萄糖醛酸結合產物（HM3）、哈巴苷苷元脫水硫酸酯化產物（HM4、HM5、HM7）、哈巴苷苷元還原甲基化產物（HM6、HM12）、哈巴苷水解并還原產物（HM8）、哈巴苷水解并脫水產物（HM9、HM10）、哈巴苷苷元裂解并與葡萄糖醛酸結合產物（HM11）。

HM1在小腸、肝和糞便中檢測到，負離子一級質譜中顯示準分子離子峰[M-H]－為m/z 201.075 2，預測其分子式為C9H14O5。根據文獻[10]中哈巴苷的裂解規律可知，m/z 201.075 2為哈巴苷脫去葡萄糖基后形成的特征性裂解碎片離子；二級質譜中可見m/z 157.135 4[M-HCH3CHO]－，與哈巴苷的特征裂解碎片離子[Harpagide-H-glucosyl-CH3CHO]－一致[11]。推測該代謝產物為哈巴苷脫去葡萄糖基后形成的水解產物哈巴素（Harpagenin），HM1既是哈巴苷的代謝產物，也是玄參中的原型成分[10]，作為代謝產物未見文獻報道。

HM2為給藥大鼠尿液中檢測到的代謝產物，負離子一級質譜中顯示準分子離子峰[M-H]－為m/z 347.141 3，預測其分子式為C19H24O6。二級質譜可見碎片離子m/z 319.155 6、201.113 6、145.120 2。其中m/z 319.155 6[MH-CO]－是準分子離子峰通過丟失CO形成的碎片離子，m/z 201.113 6[M-H-cumaric acid]－為哈巴苷苷元的特征性離子，m/z 145.120 2[Cumaric acid-H-H2O]－是香豆酸的特征性碎片離子。這表明該代謝產物含有香豆酸和哈巴苷苷元結構單元，且m/z 347可能為[8-O-courmaroyl harpagide-H-glucosyl]－，8-O-courmaroyl harpagide又是玄參中的化學成分[11]，根據質譜信息并對比文獻[11-12]推測該化合物可能為8-O-courmaroyl harpagenin。

表1 哈巴苷在大鼠體內的代謝產物液質聯用分析結果（負離子模式下）Tab 1 Results of LC-MS analysis of harpagide metabolites in rats in vivo（negative ion mode）

HM3為給藥大鼠尿液中檢測到的代謝產物，負離子一級質譜中顯示準分子離子峰[M-H]－為m/z 359.095 7，預測其分子式為C15H20O10。二級質譜中可見碎片離子m/z 183.064 7、175.025 4、147.045 6。其中，m/z 183.064 7為母離子中性丟失葡萄糖醛酸基（176 Da）形成的碎片離子，且與哈巴苷苷元脫水形成的碎片離子一致；m/z 175.025 4為[Glucuronicacid-H-H2O]－，m/z 147.045 6為[Glucuronic acid-H-H2O]－，均為葡萄糖醛酸的特征性碎片離子。根據哈巴苷的裂解規律[11]，哈巴苷苷元母核上C-5位上羥基更容易脫水形成穩定的共軛結構，確定脫水的位置在5、9位，根據上述信息結合文獻數據推測該代謝產物為哈巴苷苷元脫水后的葡萄糖醛酸化產物5，9-dehydration-harpagenin glucuronide。

HM4為給藥大鼠尿液中檢測到的代謝產物，負離子一級質譜中顯示準分子離子峰[M-H]－為m/z 263.023 5，預測其分子式為C9H12O7S。二級質譜中可見m/z 183.068 0[M-H-SO3]－碎片離子，說明該化合物可能為硫酸酯化的代謝產物。對比文獻[11]發現該碎片離子與哈巴苷失去葡萄糖基后再脫去1分子的水所形成的特征性結構單元m/z 183[Harpagide-H-glucosyl-H2O]－一致，故推測該代謝產物為哈巴苷苷元脫水后形成的硫酸酯化產物5，9-dehydration-harpagenin sulfate。

HM5、HM7為給藥大鼠尿液、糞便、胃和小腸中檢測到的代謝產物，負離子一級質譜中均顯示準分子離子峰[M-H]－為m/z 245.01，預測其分子式均為C9H10O6S。負離子模式下，二級碎片離子均可見m/z 165.05[M-HSO3]－和m/z 121.07[M-H-SO3-CO2]－。對比哈巴苷的裂解規律，m/z 165.05[M-H-SO3]－與哈巴苷失去葡萄糖基后再脫去2分子水所形成的結構單元m/z 165[Harpagide-H-glucosyl-2H2O]－一致。根據以上數據推測代謝產物HM5和HM7均為哈巴苷苷元脫去2分子水后的硫酸酯化產物，母核1位和6位均有羥基可發生硫酸酯化，但空間位阻1位羥基最小，其次為6位羥基，因此優勢取代順序為1位羥基＞6位羥基。故推測峰面積較大的HM5為5，9-dehydration-7，8-dehydration-harpagenin sulfate，峰面積較小的HM7為5，9-dehydration-7，8-dehydration-harpagenin-6-sulfate。

HM6為給藥大鼠尿液和胃中檢測到的代謝產物，負離子一級質譜中顯示準分子離子峰[M-H]－為m/z 231.123 7，預測其分子式為C11H20O5。二級碎片離子可見m/z 187.101 7[M-H-CH3CHO]－和m/z 143.116 0[M-HCH3CHO-CO2]－。根據以上數據并結合文獻[12]，推測該代謝產物可能為Dihydrogen-6，8-O-dimethyl harpagenin。

HM8為給藥大鼠血液和小腸中檢測到的代謝產物，負離子一級質譜中顯示準分子離子峰[M-H]－為m/z 203.085 5，預測分子式為C9H16O5。在負離子模式的二級碎片離子可見m/z 159.110 5[M-H-CH3CHO]－。根據以上數據并結合文獻[12-13]推測該代謝產物為哈巴苷苷元的還原產物Dihydrogen-harpagenin。

HM9為給藥大鼠尿液中檢測到的代謝產物，負離子一級質譜中顯示準分子離子峰[M-H]－為m/z 183.066 3，預測其分子式為C9H12O4。其準分子離子峰與哈巴苷脫去葡萄糖和水分子后形成的特征性裂解碎片m/z 183 [Harpagide-H-glucosyl-H2O]－一致，且二級質譜圖中出現了哈巴苷苷元脫水后再失去-CH3CHO形成的碎片離子m/z 121.201 3。因此，推測該代謝產物為5，9-dehydration-harpagenin。

HM10為給藥大鼠尿液和胃中檢測到的代謝產物，負離子一級質譜中顯示準分子離子峰[M-H]－為m/z165.057 6，預測其分子式為C9H10O3。其準分子離子峰與哈巴苷失去葡萄糖基后再脫去2分子水所形成m/z 165 [Harpagide-H-glucosyl-2H2O]－的碎片離子一致，且二級碎片離子可見m/z 147.058 4[M-H-H2O]－，哈巴苷苷元母核上C-5位的羥基更容易脫水形成穩定的共軛結構。綜合上述信息及文獻[11]推測該代謝產物為哈巴苷苷元的脫水產物5，9-dehydration-7，8-dehydration-harpagenin。

HM11為給藥大鼠尿液中檢測到的代謝產物，負離子一級質譜中顯示準分子離子峰[M-H]－為m/z 349.113 7，預測其分子式為C18H22O7。二級碎片離子可見m/z 193.036 2[Glucuronicacid-H]－、m/z 175.027 4[Glucuronic acid-H-H2O]－、m/z 173.082 2[M-H-glucuronyl]－和m/z 129.094 7[M-H-glucuronyl-CO2]－，其中m/z 173.082 2與哈巴苷苷元的碎片m/z 173[Harpagenin-H-CO]－一致，因此推測該代謝產物為哈巴苷苷元脫羰基后形成的1，2，4-三羥基-4-甲基-1-乙醛-環戊烷與葡萄糖醛酸生成的苷。苷元1、2、4位均有羥基可發生葡萄糖醛酸化，2位羥基空間位阻最小，因此羥基取代可能發生在2位上。根據以上數據信息推測HM11為1，2，4-trihydroxyl-4-methyl-1-acetaldehyde-cyclopentane-2-O-glucuronide。

HM12為給藥大鼠尿液、小腸和胃中檢測到的代謝產物，負離子一級質譜中顯示準分子離子峰[M-H]－為m/z 217.108 9，預測其分子式為C10H18O5。二級質譜信息中可見m/z 199.100 0[M-H-H2O]－、m/z 186.529 7[M-HCH3O]－和m/z 157.092 3[Harpagide-H-glucose-2H2O]－。根據質譜信息及文獻[12]推測該代謝產物可能為Dihydrogen-methyl-harpagide母離子中性丟失葡萄糖基（162 Da）形成；根據甲基取代基的空間位阻大小，甲基化最有可能發生在6位羥基。因此，推測該代謝產物為Dihydrogen-6-O-methylharpagenin。

2.7 哈巴苷在大鼠體內的代謝類型

本研究結果顯示，哈巴苷采用液質聯用技術，從大鼠含藥尿液、血漿和糞便中共鑒定出12種哈巴苷代謝產物，發現哈巴苷在大鼠體內的代謝類型主要包括水解、脫水、還原、甲基化、硫酸酯化、葡萄糖醛酸結合、一級香豆酸結合等。根據代謝產物的結構特點及代謝反應類型，推測哈巴苷在大鼠體內的代謝類型見圖3。

圖3 哈巴苷在大鼠體內可能的代謝類型Fig 3 The possible metabolic type of harpagide in rats in vivo

2.8 哈巴苷原型及其代謝產物在大鼠體內的分布

哈巴苷原型及其代謝產物體內分布研究發現，哈巴苷原型在心、肝、脾、肺、腎、胃和小腸中均有分布；在小腸中檢測到HM1、HM5、HM7、HM8和HM12共5種代謝產物；在胃中檢測到HM5、HM6、HM7、HM10和HM12共5種代謝產物；在肝臟中檢測到HM1。推測哈巴苷主要分布于胃、小腸和肝。

2.9 哈巴苷在大鼠體內代謝產物的活性預測

采用藥物活性預測軟件“Pharm Mapper”，對12種代謝產物進行活性預測分析。結果，多種代謝產物顯示多種不同的潛在活性，且不同代謝產物可能具有相同的潛在靶點和潛在活性。HM1、HM3、HM9可能具有治療癲癇的相關活性；HM1、HM6、HM9、HM12可能具有治療肌萎縮側索硬化（ALS）的相關活性；HM2、HM3、HM10可能具有治療糖尿病的相關活性；HM5和HM8可能具有治療腦中風的相關活性等。這些代謝產物活性與哈巴苷的免疫調節作用和神經保護作用[6，8]，以及玄參的免疫調節、神經保護和調節血糖作用[3，14-15]有一定的相關性。哈巴苷代謝產物結構多相似，結構相似的代謝產物也預測出其具有相同的作用靶點，如HM1和HM9，HM6和HM12，這與徐風等[16]提出的多成分單靶點的中藥顯效形式新理論一致。哈巴苷代謝產物的主要活性預測結果見表2。

表2 哈巴苷在大鼠體內代謝產物的生物活性預測結果Tab 2 Prediction results of biological activity of harpagide metabolites in rats in vivo

3 討論

環烯醚萜類成分的苷元結構相對穩定，因此哈巴苷在進入體內后通過各種代謝途徑，產生了結構相似的代謝產物。經過活性預測，哈巴苷的多種代謝產物具有治療癲癇、ALS、糖尿病和腦中風等疾病的潛在活性。這些代謝產物的潛在活性與哈巴苷的免疫調節作用和神經保護作用[6，8]以及玄參的免疫調節、神經保護和血糖調節作用有一定的相關性[3-4，15]。這說明采用PharmMapper軟件預測代謝產物的生物活性具有一定參考價值。文獻報道傳統的產地加工炮制方法可使玄參中哈巴苷含量升高[9-10]。王靜哲等[10]也發現，炮制玄參中哈巴苷含量為烘干玄參的124%。哈巴苷體內代謝研究有助于揭示玄參炮制機制，哈巴苷與其代謝產物可能為玄參發揮藥效的重要物質基礎。通過本研究發現的12種哈巴苷代謝產物及其可能代謝途徑，為玄參“歸胃經”、歸屬玄參在大鼠體內代謝產物的原型成分來源提供了重要依據，有助于揭示哈巴苷的體內顯效形式及其作用機制。

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Identification and Analysis of Harpagide Metabolites in Rats in vivo

LIU Zhen，XU Feng，WANG Jingzhe，LIU Guangxue，SHANG Mingying，CAI Shaoqing（School of Pharmaceutical Sciences，Peking University，Beijing 100191，China）

OBJECTIVE：To study the metabolites，distribution，metabolic type and the possible activity of harpagide which is the active component from Scrophularia ningpoensis in rats in vivo.METHODS：4 SD rats were divided into blank group（ultrapure water）and administration group（harpagide reference solution），2 in each group，ig，160 mg/kg，twice a day，for 3 d.Urine and feces were collected every 12 h before administration and the first administration；sample blood 8 mL was taken after 0.5，1 hof last administration；heart，liver，spleen，lung，kidney，stomach and small intestine were taken.The blood，urine，feces and other tissue solutions were prepared，HPLC-MS was conducted to detect and identify the harpagide metabolites in rats in vivo and presume metabolic pathways，and PharmMapper software was used to predict metabolites activity.RESULTS：12 harpagide metabolites were identified in rats in vivo，the form of prototypes and metabolites were distributed in heart，liver，spleen，lung，kidney，stomach and small intestine.The metabolic type mainly included hydrolysis，dehydration，reduction，methylation，sulfation，glucuronic acid binding，grade A coumaric acid binding，etc.The 12 compounds may have activities in the treatment of epilepsy，amyotrophic lateral sclerosis，diabetes，stroke，etc.CONCLUSIONS：Harpagide may be effective in the form of prototypes and metabolites.The study has provided basis for attributing the origins of metabolite，studying the effective form of S.ningpoensis clarifying its pharmacological mechanism and processing mechanism.

Scrophularia ningpoensis；Harpagide；LC-MS；Metabolite；Metabolic pathway；Activity

R931.6

A

1001-0408（2017）10-1310-06

2016-05-28

2017-01-09）

（編輯：劉明偉）

國家自然科學基金資助項目（No.81274074）

＊碩士研究生。研究方向：中藥質量評價。電話：010-82802535。E-mail：386436070@qq.com

#通信作者：副教授，博士。研究方向：中藥質量評價。電話：010-82802535。E-mail：myshang@bjmu.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.04