肝癌組織中腎上腺髓質激素的表達及與微血管密度的關系

姚 楊，徐 銳，蘆 江，蘇 杰，葉 蕓

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·基礎醫學· ·論著·

肝癌組織中腎上腺髓質激素的表達及與微血管密度的關系

姚 楊，徐 銳，蘆 江，蘇 杰，葉 蕓

目的 研究腎上腺髓質激素(ADM)在肝癌組織中的表達及其與腫瘤血管生成的關系。方法 采用免疫組化法檢測26例正常肝組織及58例肝癌組織中ADM表達，同時計數CD105標記的微血管密度(MVD)，探討ADM與MVD及臨床病理特征之間的關系。結果 肝癌組織ADM蛋白表達明顯高于正常肝組織(P<0.01)，肝癌組織中MVD明顯高于正常肝組織(P<0.01)。兩者的表達與患者年齡、病理類型無明顯關系(P>0.05)，而與腫瘤分化程度及TNM分級有一定關系(P<0.05)。結論 肝癌組織中ADM的高含量，其與腫瘤血管生成有關，在肝癌發生發展過程中起重要作用，可作稱為肝癌病變生物學行為的重要指標。

乙肝相關性肝癌；腎上腺髓質激素；CD105

腎上腺髓質激素(ADM)是新近發現的一種血管活性物質，在體內廣泛分布，具有強大而持久的擴血管作用[1-3]。其在腫瘤中的作用日益受到關注，它可以促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，刺激血管生成，抑制免疫反應，從而對腫瘤的發生發展其重要作用[4-6]。CD105(endoglin)是一種特異性的新生血管內皮標記物[7]，它在乳腺、大腸、肺等多種腫瘤中高表達，被認為是一個新的腫瘤血管治療靶點[8]。本研究采用免疫組化法檢測ADM在肝癌組織及正常肝組織中的表達，及其與微血管密度(MVD)及臨床病例特征的關系，旨在提高肝癌的早期診斷率，探討其作為一種新的評估預后指標的可能性，并為肝癌的治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集西安醫學院附屬醫院2012-2013年行肝癌手術標本58例，男27例，女31例，年齡60～78歲。腫瘤分期采用2010年第7版AJCC分期，其中Ⅰ～Ⅱ期25例，ⅢA～C～ⅣA、B期33例；按分化程度分類，高分化24例，中分化12例，低分化22例。淋巴轉移良性者19例，陰性39例。所有患者術前未進行放療和化療。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 免疫組化 取石蠟標本切片，60 ℃烤2 h，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，PBS洗3次，每次3 min；0.3% TritonX-100室溫孵育20 min，3% H2O2室溫孵育15 min，以滅火內源性過氧化物酶；10%山羊血清封閉，室溫30 min；甩去多余液體，不洗；加入1∶50稀釋的鼠抗人ADM單克隆抗體(美國SantaCruz公司)，或鼠抗人CD105單克隆抗體(滴度為1∶70)，37 ℃ 1～2 h，0.01 mol/L PBS洗5 min，3次，加二抗，37 ℃ 45 min。0.01 mol/L PBS洗5 min，4次，DAB顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片。同時以PBS代替第一抗體作為陰性對照。

1.3 判定標準 ADM以細胞胞質和(或)胞膜中出現棕黃色顆粒為陽性細胞。隨機選取10個高倍視野，計算每個視野內100個腫瘤細胞中陽性染色的細胞數，即陽性細胞的百分數，并取平均值。腫瘤內微血管密度計數：CD105主要使新生血管內皮細胞染成棕黃色，以每個染成棕黃色的可以與周圍血管、腫瘤細胞及其他結締組織相分離的內皮細胞或內皮細胞簇，認定為一個單一的可以計數的微血管。MVD計數和評定采用Weidneris法：低倍視野(×100)光鏡下全面觀察切片，選取腫瘤微血管數量(CD105)最豐富的區域，再于高倍視野(×400)下，計數每個區域微血管數量，每張切片記錄5個高倍視野下微血管數目，以其平均值作為每例的MVD，用MVD值來表示CD105的表達量。

1.4 統計學處理 采用SPSS 12.0統計軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗，計量資料均數±標準差(x±s)表示，兩兩比較采用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ADM和CD105在肝癌組織及正常肝組織中的表達 ADM在正常肝組織中的表達為35.18%，明顯低于肝癌組織的78.72%。在肝癌組織中可見大量癌細胞呈陽性表達，呈棕黃色，數量多而濃。在肝癌組織中CD105標記的微血管呈現棕褐色，陽性部位在血管內皮細胞膜，腫瘤組織內染色呈散狀分布，肝癌組織中CD105-MVD為48.27±13.36，明顯高于正常肝組織(38.23±15.60)。肝癌組織中ADM陽性表達率和CD105-MVD分別高于正常肝組織，ADM和CD105-MVD在肝癌組織和正常肝組織中的表達差異均具有統計學意義(P<0.01)。具體見圖1、2。

注：A：肝癌組織中ADM的表達，B：正常肝組織中ADM的表達，C：肝臟組織中CD105的表達，D：正常肝組織中CD105的表達。ADM：腎上腺髓質激素圖1 ADM及CD105在肝癌及正常肝組織中免疫組化結果(×200)

注：A：肝癌組織中ADM的表達，B：正常肝組織中ADM的表達，C：肝臟組織中CD105的表達，D：正常肝組織中CD105的表達。ADM：腎上腺髓質激素圖2 ADM及CD105在肝癌及正常肝組織中免疫組化結果(×400)

2.2 ADM和CD105-MVD的表達與臨床病理特征的關系 肝癌組織中， ADM在低、中、高分化肝癌的陽性率分別為95.24%、54.54%和40.91%，CD105-MVD計數在低、中、高分化肝癌分別為52.87±13.25、50.27±14.54和48.24±15.60，不同分化程度間ADM與CD105-MVD的表達差異均具有統計學意義(P<0.01)，其表達量關系為低分化>中分化>高分化；ADM與CD105-MVD的表達隨病理分化程度的增高而降低。有淋巴結轉移者ADM和CD105-MVD的表達顯著高于無淋巴結轉移者(P<0.05)。TNM分期中，Ⅰ～Ⅱ期ADM與CD105-MVD的表達明顯低于ⅢA～C～ⅣA、B期，差異均具有統計學意義(P<0.01)。58例肝癌中ADM與CD105-MVD的表達與腫瘤分化程度及TNM分期相關(P<0.01)，與患者年齡、性別、腫瘤大小無明顯相關(P>0.05)。見表1。

表1 腎上腺髓質激素與臨床病理參數的關系

注：與中分化比較aP<0.05；與低分化比較bP<0.01；與Ⅰ～Ⅱ期比較cP<0.01

3 討論

肝癌是一種世界范圍內常見的惡性腫瘤，在我國自90年代以來已經上升為惡性腫瘤致死的第二位因素[9]。盡管隨著醫學科學的不斷進步和發展，出現了許多治療手段，但是根治性切除仍然是首選的治療方法，但術后復發轉移率依然是影響療效的主要原因[10]。因此，研究其發病與轉移機制，尋找新的治療方法是目前肝癌治療中的一個重要課題。

ADM是Kitamura等[11]從人的嗜絡細胞瘤中發現并分離出來的一種內源性血管活性肽，在腎上腺髓質中的含量最高。由血管內皮細胞核血管平滑肌細胞合成分泌[12-14]，可作為一種血管舒張劑、支氣管擴張劑、激素分泌調節劑、神經傳遞介質等發揮作用[15-16]。

血管生成對于腫瘤的進展、轉移和復發至關重要，而血管的發生受一系列正負因子的調控，CD105為細胞膜糖蛋白，是TGF-B受體復合物的成分之一，能調節細胞對TGF-B的但應，是新生血管的標志[17-18]。

本研究采用免疫組化法分別檢測肝癌組織及正常肝組織中ADM和CD105的表達。結果表明肝癌組織中ADM和CD105-MVD的陽性表達率較正常肝組織明顯升高。進一步比較顯示：ADM在低、中、高分化肝癌的陽性率分別為95.24%、54.54%和40.91% ，CD105-MVD計數在低、中、高分化肝癌分別為52.87±13.25、50.27±14.54和48.24±15.60。不同分化程度間ADM與CD105-MVD的表達差異均具有統計學意義，其表達量關系為低分化>中分化>高分化，ADM與CD105-MVD的表達隨病理分化程度的增高而降低。

淋巴轉移是肝癌轉移的重要途徑，淋巴轉移與否是影響病變進展和預后的關鍵因素之一。本研究發現有淋巴結轉移者ADM和CD105-MVD的表達顯著高于無淋巴結轉移者。TNM分期中，Ⅰ～Ⅱ期ADM與CD105-MVD的表達明顯低于ⅢA～C～ⅣA、B期，差異均具有統計學意義；兩者表達水平與隨TNM分期的增高而降低。58例肝癌中ADM與CD105-MVD的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小無明顯相關。

綜上所述，由于分化程度和淋巴結轉移是與肝癌惡化和預后密切相關的兩個重要指標，可以根據肝癌患者中ADM的水平及MVD測定來識別肝癌早期的高?；颊撸u估患者的預后，為患者提供合理恰當的治療方案。

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(本文編輯：林永麗)

Expression of ADM in human liver carcinoma and its relationship with the density of micro vessels

YaoYang,XuRui,LuJiang,SuJie,YeYun

(DepartmentofCentralLaboratoryofFirstHospitalAffiliatedtoXi′anMedicalUniversity,Xi′an710077，China)

Objective To investigate the expression of ADM in human liver carcinoma and its relationship with tumor angiogenesis. Methods The expression level of ADM was detected in 26 cases of normal liver tissues and the level of ADM in 58 cases of liver carcinoma by immunohistochemical method. At the same time, the number of CD105-labelled micro vessel density (MVD) was counted, so as to investigate the relationship between ADM, MVD and their clinical pathological features.Results The expression levels of ADM and MVD in liver carcinoma were significantly higher than those in normal tissues (P<0.01). MVD in liver carcinoma was obviously higher than that of the normal liver(P<0.01). Their expression levels were not clearly correlated with the patient age and the pathological type (P<0.01), while tumor differentiation was correlated with the degrading of TNM to some extent(P<0.05).Conclusion The high expression of ADM in liver carcinoma was positively correlated with the formation of tumor vessels, which played a certain role in the occurrence and development of liver carcinoma, and might be important biological indicator of liver carcinoma.

Hepatitis B related liver carcinoma; ADM; CD105

西安市科技計劃項目(SF1418(6))；西安醫學院科研基金資助項目(12FZ15)；西安醫學院大學生項目(11DXS01)

710077 西安，西安醫學院附屬醫院中心實驗室(姚楊、徐銳、蘇杰、葉蕓)；西安醫學院臨床醫學學生(蘆江)

姚楊，電子信箱：yaoyang1220@sina.co

R735.7

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.02.010

2015-04-13)