合成生物學助力應急疫苗研制

袁盛凌，王艷春，劉純杰

軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071

綜述

合成生物學助力應急疫苗研制

袁盛凌，王艷春，劉純杰

軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071

合成生物學具有系統性思維和工程學理念的特點，致力于創造新的生命或新的系統。合成生物學為疫苗研發人員提供了新的思路，不斷開發出新疫苗研制的技術平臺。通過抗原重構技術，合成的強抗原能夠很好地激活VRC0-1種系的B細胞；利用合成生物學合成自組裝的納米顆粒疫苗，能夠有效地暴露保守抗原；通過合成生物學完成流感疫苗基因組的快速組裝，大大縮短了疫苗的研制周期；通過系統性地改造，重組沙門菌再一次成為疫苗開發的重要工具。合成生物學在應急疫苗研發過程中疫苗研制平臺搭建及快速合成新發傳染病抗原方面發揮著突出作用。

合成生物學；疫苗；流感疫情；重組沙門菌;遞送系統

合成生物學研究建立在分子生物學、遺傳工程、代謝工程、生物信息學、系統生物學及各種組學研究的基礎之上，其定義是：利用工程理念理性合成復雜的、具有生物意義的不同層次系統——從單個生物分子到整個細胞、組織、器官、個體乃至群體，執行自然界中沒有的功能。

合成生物學作為最新的思維工具和技術手段，幫助研究人員不斷拓展新的研究領域。比如在疫苗研發過程中，合成生物學幫助人們設計制造更有效、更通用、更及時的疫苗。在病毒肆虐的今天，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）、埃博拉病毒（Ebola virus）、寨卡病毒（Zika virus）等病原微生物，正在不斷威脅著人類的健康。隨著全球人群的流動性越來越大，疫情傳播速度極快，疫情防控迫在眉睫。研制有效的應急疫苗是科研人員義不容辭的責任。合成生物學的研究方法能夠更好地為科研人員搭建疫苗研制平臺，鍛煉應急疫苗研制的技術能力，在真正疫情到來之時，將平臺上的抗原組件進行替換，通過平臺技術銜接，在最短的時間內生產出適應疫情的疫苗，讓科研力量成為保護人類健康、維護社會穩定的堅強后盾。

1 合成生物學幫助設計HIV強抗原

如果天然病毒的免疫原性比較弱，可以利用合成生物學合成模擬病毒顆粒的強免疫原。一直以來，人免疫缺陷病毒（HIV）的包膜糖蛋白雖然可以激發機體產生中和抗體，但人體產生的中和抗體卻極少，主要原因是：①天然的包膜糖蛋白的免疫原性弱；②免疫原具有高度變異性；③免疫原被最外層的糖苷類物質包裹。以上三個原因使得天然病毒不能有效刺激人體的免疫系統，產生的有效中和抗體少之又少。所以，設計強免疫原是研制有效的艾滋病疫苗的關鍵。

VRC01類廣譜中和抗體，可以特異性地針對HIV gp120上的CD4結合位點，所以被認為是對抗病毒的有效抗體。然而天然的HIV蛋白無法結合或刺激VRC01的種系B細胞，因此無法啟動抗體反應過程。研究者著手設計一種能夠實現這一過程的人工免疫原[1]。他們利用蛋白質建模軟件，改善了VRC01種系B細胞抗體與HIV包膜蛋白結合能力；隨后生成了包含所有可能的有益突變組合的文庫，獲得了數以百萬計的突變體，利用酵母表面展示技術和FACS對它們進行篩查，結合計算機預測和定向演化，生成了幾個對種系VRC01類抗體具有高親和力的突變包膜蛋白，利用eOD軟件確定了優化的eOD-GT6免疫原。采用X線晶體學確定了這種免疫原的3D原子結構、VRC01抗體的晶體結構，以及免疫原與抗體結合在一起的結構。在此基礎上，研究人員設計合成了納米級自組裝的模擬病毒顆粒（圖1），其由60個拷貝的單體聚合而成，每一個單體由二氧四氫蝶啶合成酶融合包膜糖蛋白eOD-GT6而構成，eOD-GT6上糖苷的位置完全不會遮蔽免疫原。這個模擬的納米病毒顆粒極好地激活了培養皿中的VRC01種系B細胞，甚至成熟B細胞，而單拷貝eODGT6則不能。這充分說明通過重構免疫原的結構和組裝形式，可以獲得很好的免疫效果。

圖1 60聚體的eOD-GT6納米顆粒

2 合成生物學幫助設計通用流感疫苗

與HIV包膜蛋白類似，流感病毒血凝素抗原總是隱藏在分子內部，天然病毒結構不能很好地暴露這些保守的抗原表位。利用合成生物學的方法，可以將HA抗原被遮蔽的部分進行有效暴露，更有利于機體產生針對保守區段的廣譜的中和抗體[2]。血凝素HA是流感病毒衣殼上的主要抗原性蛋白，而鐵蛋白（ferritin）是來自幽門螺桿菌的能夠自然形成球狀簇的離子轉運蛋白。研究人員將這2種蛋白融合起來，生成能夠自動裝配的HA-ferritin復合體。該復合體從鐵蛋白核心伸出由HA組成的8個突起，模擬流感病毒衣殼上的天然HA突起。這種設計能使血球凝集素上的HA分子變得疏散，不會被其他衣殼蛋白遮蔽，能讓免疫系統獲取更全面的信息，靶向不同流感菌株的通用HA位點，包括識別宿主細胞特定受體的頭部和幫助病毒入侵的莖部（圖2）。

圖2 自組裝的納米顆粒流感通用疫苗的設計

3 合成生物學幫助應急流感疫苗的研發

傳統的流感疫苗從研制到上市最快需要幾個月的時間，如2009年H1N1甲型流感病毒疫苗，在沒有合成生物學技術支持的情況下，雖然以前所未有的速度進行研制和生產，但疫苗上市時仍然遺憾地錯過了H1N1流感病毒肆虐的高峰期，錯過了人群的最大需求時期，沒有發揮應有的作用。

2013年，當新型流感病毒毒株H7N9在中國出現的時候，一個重要問題擺到人們面前：一旦這種流感病毒或其他病毒大規模來襲，人們是否能足夠快地生產出足量疫苗應對疫情？應急流感疫苗的研制技術將決定在疫情防控大戰中人類是否能夠掌握主動。利用合成生物學的方法，J.Craig Venter的合成基因組公司與疫苗制造商瑞士諾華公司聯合設計了合成流感疫苗基因組的快速研發方式[3]。這種合成方式分為兩步：第一步是變異的HA和NA基因的全基因人工合成，第二步是新合成的變異基因與流感病毒的主干基因融合，制造雜合基因組，快速完成病毒拯救。

在變異的HA和NA基因的全基因人工合成中，文特爾研究所的研究人員用不到1天的時間即可將新發流感病毒的序列從網上下載、設計序列片段、人工拼接、獲得病毒的HA和NA基因的正確序列。在這項應急疫苗研制項目中，文特爾研究團隊創建了一種恒溫一步法組裝技術，稱作“Gibson恒溫組裝法”，即利用5'核酸外切酶、高保真DNA聚合酶及連接酶的協調作用，在體外將多個帶有重疊區的DNA片段組裝起來，再利用error correct ErrASE商業糾錯試劑盒糾正序列中的錯誤匹配，快速而準確地合成HA和NA基因（圖3A），僅僅這項技術就比其他基因合成公司的合成時間縮短了3～5天。

隨后由諾華公司負責，將人工合成的HA和NA基因拼接到PR8基因組中，合成流感病毒雜合基因組，進行病毒拯救。他們選用的主干基因是改進型的，盡量保證病毒基因間的組配達到最佳；選用的宿主細胞是疫苗工業生產許可的狗腎細胞（MDCK），在病毒拯救過程中，直接用這種細胞篩選病毒滴度高的病毒株。在嚴謹設計下，從拿到流行毒株序列，到合成出種子病毒，僅僅需要5天時間（圖3B），將疫苗生產時間至少縮短了4周。

2013年3月31日，中國疾控中心宣布了人類H7N9傳染病，并在在線數據庫中儲存了該病毒的基因組序列。次日，美國圣迭戈市文特爾研究所的科學家就合成了該病毒的HA和NA基因，之后他們立即將合成物送到諾華公司實驗室，并與PR8融合，4月6日即制成了首個種子病毒。合成生物學助力的流感病毒疫苗的快速研制技術，成為人類戰勝疫情的重要武器。

圖3 流感應急疫苗合成時間表

4 合成生物學讓活菌載體疫苗重新煥發新的生命

減毒沙門菌作為遞送載體，已經研究了近30年。沙門菌能夠侵入組織和細胞，全面激發機體的體液免疫、黏膜免疫和細胞免疫，免疫原性強，維持時間長。限制該活菌載體廣泛應用的原因之一是毒性和免疫原性的平衡問題。如果減毒充分，此活菌載體的侵入性將變弱，免疫原性變差；而如果要保持其免疫原性，其殘留的毒力又是疫苗安全性的一大障礙。利用合成生物學的原理，亞利桑那州立大學Roy CurtissⅢ實驗室設計了重組減毒沙門菌疫苗（recombi?nantattenuated Salmonella vaccine，RASV）遞送系統，該載體以可調節的延遲裂解為特色，保持了載體的侵入、定植能力，具備出色的免疫效果；同時，巧妙設計基因的表達，使其侵入組織后自行裂解，充分減毒[4]。它的設計原理主要是根據體外-腸道-淋巴組織中必需營養物質（如甘露糖或阿拉伯糖）逐漸匱乏的原理，構建營養缺陷菌株，毒力和功能受到環境營養物質濃度嚴格控制。體外培養時，阿拉伯糖來源充分，負責細菌細胞壁、脂多糖合成的基因如asd、murA在體外表達，負責細菌代謝的基因如fur、crp也在體外表達；口服入腸道后，阿拉伯糖來源減少，但asd、murA、fur、crp能繼續表達，保持侵入淋巴組織的毒力；入侵淋巴組織后，由于缺乏阿拉伯糖，上述4種基因表達關閉，細菌裂解，毒力喪失；與此同時，受阿拉伯糖調控表達的阻遏蛋白不再產生，使保護性抗原表達解除抑制，在淋巴組織中大量表達，使抗原得到有效遞送。他們利用RASV構建了肺炎球菌疫苗，取得了非常好的免疫效果和保護效果[5]。在此基礎上，研究團隊還設計合成了遞送WSN流感病毒HA基因的DNA疫苗。此遞送系統含有真核轉錄元件，當RASV侵入宿主細胞后，啟動裂解行動，釋放DNA載體。DNA載體入核后，開始表達相關抗原，激發宿主系統性的免疫應答。為了更好地呈現遞送載體的優勢，他們通過刪除基因或增添新的元件，使新的遞送體系具備如下特征：具有更好的侵入能力；最大限度地內在化，避免其在胞質中釋放DNA疫苗；降低入侵造成的細胞凋亡或程序性死亡；增加DNA對宿主核酸酶的抗性；添加DNA核靶向序列（DTS）和核定位序列，以便DNA疫苗能夠入核，有效地合成編碼的保護性抗原。如此精心設計合成的流感疫苗，可以達到對小鼠100%的免疫保護[6]。此DNA疫苗可以快速制備，隨病原的不同而隨時改變DNA序列，比如可以將WSN流感病毒HA基因替換為其他型別的HA基因，或替換為埃博拉病毒的包膜糖蛋白GP基因。基于全新的RASV遞送系統的DNA疫苗有望成為應對未知或新型生物威脅的有效防御手段。

5 應急疫苗研制過程中合成生物學的助力點

合成生物學正在蓬勃發展，它的最大特點就是創造：從創造新的生命、新的代謝通路到創造新的分子、新的遞送工具……，合成生物學在疫苗研制方面為研究人員提供了更廣的空間，更自由的設計。在新疫苗開發上，可以根據中和性抗體來設計并合成與之相對應的保護性抗原，為疫苗的設計提供了全新的角度；在疫苗的形式方面，可以設計成納米顆粒，充分有效地暴露免疫原，并以聚體的形式增強其免疫原性；在疫苗遞送方面，從系統的角度改進舊有的遞送載體，讓其呈現出最理想遞送效果和絕對的安全性；從疫苗的研制效率方面，極大地縮短疫苗研發生產的時間，使人們面對流感疫情時不再束手無策。

因此，合成生物學為疫苗研制提供了全新的技術平臺和技術路線。從工程的角度考慮，這些技術平臺和技術路線就像模塊一樣，方便組裝和替換，利用不同的元件，可以組裝成不同的疫苗。而不同病原微生物的保護性抗原，則是技術平臺中的一個個可變模塊，它們與對應模塊之間的相互替換，在原則上并不會改變整個技術平臺的穩定性和有效性。比如每一次流感大流行可能會遭遇到不同的流感病毒，而在科研人員看來，不同的流感病毒只是換了HA和NA抗原蛋白的老朋友，因此，將新的HA和NA序列與已有的流感疫苗研制平臺銜接，就可以快速制造適應新疫情的流感疫苗。

圖4 應急疫苗的研制流程

其次，合成生物學技術可以保證在突發疫情來臨時，可以根據病原基因組序列進行迅速分析和保護性抗原基因的快速人工合成，并且在這一點上速度可以做到極致（1天之內），有效地節約了異地甚至異國采樣的路途奔波時間或樣品郵寄過程所耽誤的時間。

可以想見，當新的疫情悄然來襲時，疾控人員迅速到位，采集樣品進行病原分析鑒定，其基因組數據在第一時間上傳至聯網數據庫；疫苗研制人員則在第一時間下載數據，進行保護性抗原基因的人工合成并對接平臺技術，合成對應疫情的新疫苗，比如病毒顆粒疫苗、納米顆粒疫苗、新型遞送載體類疫苗等；之后，疫苗的生產迅速啟動，在最短的時間內拿到新發傳染病的人群接種疫苗。這是多么令人盼望的一刻，但也是現有技術通過整合完全能夠做到的事。合成生物學在應急疫苗的構建和平臺建立方面均起到了很好的支持作用，為疫情防控打下了堅實的基礎。

[1]Jardine J,Julien J P,Menis S,et al.Rational HIV immunogen design to target specific germline B cell receptors[J].Science,2013,340(6133):711-716.

[2]Kanekiyo M,Wei C J,Yassine H M,et al.Self-as?sembling influenza nanoparticle vaccines elicit broad?lyneutralizingH1N1 antibodies[J].Nature,2013,499 (7456):102-106.

[3]Dormitzer P R,Suphaphiphat P,Gibson D G,et al.Synthetic generation of influenza vaccine viruses for rapid response to pandemics[J].Sci Transl Med, 2013,5(185):185ra68.

[4]Curtiss R 3rd,Wanda S Y,Gunn B M,et al.Sal?monella enterica serovar Typhimurium strains with regulated delayed attenuation in vivo[J].InfectIm?mun,2009,77(3):1071-1082.

[5]Li Y H,Wang S F,Scarpellini G,et al.Evalua?tion ofnew generation Salmonella enterica serovar Typhimurium vaccines with regulated delayed attenua?tion to induce immune responses againstPspA[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(2):593-598.

[6]Kong W,Brovold M,Koeneman B A,et al.Turn?ing self-destructing Salmonella into a universal DNA vaccine delivery platform[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(47):19414-19419.

Synthetic Biology Contributes to Rapid Production of Vac?cine for Emergency Use

YUAN Sheng-Ling,WANG Yan-Chun,LIU Chun-Jie*
Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071,China
*Corresponding author,E-mail:Liucj@nic.bmi.ac.cn

Synthetic biology,the engineering of biology,aims to synthesis of complex,biologically based systems to display functions that do not exist in nature.In this review,we focused on new ideas and new technology plat?forms provided by synthetic biology for the vaccine development.Through the technology of antigen reconstruction, a more effective immunogen was synthesized and could activated germline and mature VRC01-class B cells;selfassembling influenza nanoparticle vaccine induces antibodies targeting conservative regions of both the HA stem and the HA head,and produce antibodies against a wider range of flu strains than traditional vaccines;synthetic vaccine seeds will be assembled and rescued rapidly,which would accelerate responses to influenza pandemics;by systematic reconstruction,recombinant attenuated Salmonella vaccine（RASV）strains exhibiting both hyperinvasive phenotype and delayed lysis phenotype becomes a universal DNA vaccine-delivery vehicle.In all,synthetic biolo?gy plays an important role in new technology platforms and rapid assembly of the pathogenic microorganism anti?gens during vaccine development against emerging infectious diseases.

synthetic biology;vaccine;influenza pandemics;recombinant attenuated Salmonella vaccine;delivery vector

Q-3;R392

A

1009-0002（2017）01-0044-06

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.01.008

2017-01-02

袁盛凌（1973-），女，副研究員

劉純杰，（E-mail）Liucj@nic.bmi.ac.cn