重組腺病毒載體埃博拉疫苗的工藝特點和技術(shù)創(chuàng)新

?撰稿 朱濤

論壇

重組腺病毒載體埃博拉疫苗的工藝特點和技術(shù)創(chuàng)新

?撰稿 朱濤

朱濤，天津科技大學(xué)教授，國家千人計劃入選者。1998年獲清華大學(xué)化學(xué)工程碩士學(xué)位，2002年獲美國匹茲堡大學(xué)生物化學(xué)工程博士學(xué)位。2002-2004年在美國卡內(nèi)基梅隆大學(xué)從事博士后研究；2004-2005年在芝加哥 IntegratedGenom?ics Inc任職科學(xué)家，從事生物信息學(xué)和代謝工程的研究；隨后加入世界疫苗巨頭——賽諾菲巴斯德(Sanofi Pasteur)從事疫苗開發(fā)。2009年回國創(chuàng)辦天津康希諾生物技術(shù)有限公司，專業(yè)從事疫苗及其他生物制品的開發(fā)，任公司研發(fā)副總、首席科學(xué)家。

埃博拉病毒病（Ebola virus disease，EVD），是迄今發(fā)現(xiàn)的感染性最強的傳染性疾病之一。埃博拉病毒屬分5個亞種，即埃博拉-扎伊爾型（EBO-Zaire）、埃博拉-蘇丹型（EBO-Sudan）、埃博拉-萊斯頓型（EBO-Reston）、埃博拉-科特迪瓦型（EBO-tai forest）和本迪布焦型（EBO-bun?dibugyoe）[1]。不同亞種具有不同的特性，EBOZaire和EBO-Sudan對人類和非人類靈長類動物的致病性和致死率很高；2014年西非爆發(fā)的埃博拉疫情就是EBO-Zaire引起的。EBO-Reston對人類不致病，對非人類靈長類動物具有致死性作用；EBO-tai forest對人類有明顯的致病性，但一般不致死，對黑猩猩的致死率很高。

目前沒有有效的藥物可以治療埃博拉感染性疾病，WHO推薦的治療原則是口服或靜脈補液以維持電解質(zhì)平衡，維持血壓，控制體溫和治療并發(fā)癥等綜合措施，但是這些治療的主要目標(biāo)是阻止或者緩解疾病所造成的損傷，減輕病痛，臨床效果一般。通常采取快速大規(guī)模的隔離、針對死者的安全深埋和輔助治療等措施綜合來控制埃博拉爆發(fā)流行。開發(fā)有效針對埃博拉病毒的疫苗對于防治病毒的再次爆發(fā)流行有重要的作用。

我國研發(fā)的埃博拉疫苗采用重組腺病毒載體技術(shù)，是本輪流行期國際上第3個進入臨床研究的埃博拉疫苗，也是我國第一個在國外進行臨床研究的疫苗。本文嘗試綜述重組腺病毒載體埃博拉疫苗的工藝、產(chǎn)品特點，為同類疫苗的研發(fā)提供思路。

1 重組腺病毒載體埃博拉疫苗的放大及凍干工藝研究

用于重組腺病毒載體埃博拉疫苗生產(chǎn)的HEK293SF-3F6細胞為加拿大國家科學(xué)理事會（National Research Council Canada，NRC）開發(fā)的可在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)病毒載體和重組蛋白的細胞株。相比較傳統(tǒng)的HEK293細胞，該細胞株的主要優(yōu)勢是以無血清培養(yǎng)基作為生長條件，適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，無需微載體，可以直接放大生產(chǎn)，細胞培養(yǎng)工藝簡單。NRC在GMP條件下建立原代細胞庫，細胞株的來源清楚，馴化過程均有詳細和完整的實驗記錄，并且進行了全方位的檢定。符合GMP要求，可用于人用疫苗生產(chǎn)。康希諾公司于將NRC引進的HEK293SF-3F6細胞株作為原代，在GMP條件下復(fù)蘇該細胞株，建立主細胞庫和工作細胞庫，并獲得中檢院的合格檢定報告。

重組腺病毒載體埃博拉疫苗小試發(fā)酵工藝采用搖瓶培養(yǎng)的方法，由于生產(chǎn)用的細胞株已經(jīng)適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，因此200mL小試規(guī)模參數(shù)的探索相對容易。從搖瓶培養(yǎng)，經(jīng)7.5 L發(fā)酵罐的放大，到50 L發(fā)酵放大，再到目前的200 L發(fā)酵工藝，逐步實現(xiàn)發(fā)酵工藝的放大。細胞在發(fā)酵罐中的懸浮高密度培養(yǎng)是病毒疫苗和抗體生產(chǎn)過程中最難克服的關(guān)鍵工藝之一。實現(xiàn)細胞在不同發(fā)酵規(guī)模下的高密度培養(yǎng)，需要解決如何合理的控制溶氧，細胞生長代謝過程中會產(chǎn)酸，培養(yǎng)基pH的調(diào)節(jié)采用什么試劑，如何確定合理的pH范圍從而保證細胞的生長速度快。由于發(fā)酵罐有攪拌槳，那么攪拌過程中的剪切力對細胞生長的影響如何消除等等，只有解決這些技術(shù)才可以實現(xiàn)細胞懸浮高密度的培養(yǎng)。目前重組腺病毒載體埃博拉疫苗采用一次性反應(yīng)器的生產(chǎn)技術(shù)，已經(jīng)實現(xiàn)200 L發(fā)酵規(guī)模的生產(chǎn)。

同理，病毒感染過程中需要確定最佳的感染時間，最佳的感染量（MOI），病毒感染后在病毒繁殖期間，維持細胞生長所需要的最佳pH、最佳溶氧以及降低攪拌槳對細胞活性的影響。病毒感染后什么時候收獲細胞可以使病毒的產(chǎn)量最高。每一個因素都影響最后回收樣品的病毒滴度（IFU）。從200mL的搖瓶工藝開始就探索每一個參數(shù)，7.5 L和50 L發(fā)酵規(guī)模放大的時，基于小試工藝參數(shù)進行再次優(yōu)化，最終實現(xiàn)200 L規(guī)模下高表達的病毒生產(chǎn)工藝。

重組腺病毒載體埃博拉疫苗的純化，需要實現(xiàn)三個目的：第一，疫苗的純度大于90%，一般為95%，無多聚體。第二，殘余DNA和蛋白質(zhì)的含量滿足中國藥典的要求。第三，原液可在緩沖液中穩(wěn)定保存，既不聚集也不降解。原則上最佳的純化工藝是步驟相對少，回收率相對高。小試純化工藝研究中，我們嘗試個多個不同的填料，不同的填料組合，不同的緩沖液和洗脫條件，最終確定采用先通過Sepharose Q HP去除蛋白/核酸和細胞碎片，然后經(jīng)過 Capto Core 700進行病毒的精純；中試放大中進一步優(yōu)化了最佳上樣量，確定了洗脫條件和樣品的收集范圍，經(jīng)過多批次的研究結(jié)果證明，通過兩步純化工藝得到的腺病毒純度高達95%。埃博拉疫苗原液保存的緩沖液的選擇最為關(guān)鍵，是直接影響病毒活性和純度的關(guān)鍵輔料。以DOE軟件設(shè)計多種原輔料組合，通過測定37℃加速和2～8℃長期穩(wěn)定性研究中腺病毒IFU和純化的變化，最后確定適合保存埃博拉疫苗原液的最佳配方。

重組腺病毒載體埃博拉疫苗為凍干制劑，是世界上的第一個重組埃博拉疫苗凍干制劑，可在2～8℃長期保存，在37℃下暴露2周，活力不降低。凍干制劑的開發(fā)需要解決一系列技術(shù)難題，如何減少凍干前后腺病毒活力的降低，如何減少凍干過程中病毒聚集，如何合理設(shè)計凍干曲線從而保證疫苗的水分符合要求，并使產(chǎn)品具有較好的長期穩(wěn)定性，如何原輔料的配伍，以及如何保證凍干制劑的外觀符合要求，且加入稀釋劑后可快速溶解等一系列難題。此外還需要探索凍干樣品從小試，到中試放大過程中，凍干曲線是否合適，前期小試確定的凍干工藝參數(shù)是否適合中試放大，中試規(guī)模最佳的凍干曲線和制劑生產(chǎn)工藝。經(jīng)過一系列實驗，最終實現(xiàn)30 000劑/批的成品生產(chǎn)。

在WHO組織的有關(guān)埃博拉疫苗主題討論中，該制劑工藝贏得同行的贊賞。同期在非洲開展臨床實驗的以黑猩猩3型腺病毒為載體構(gòu)建的埃博拉疫苗（葛蘭素史克公司）保存在-80℃，而為了有效保證-80℃冰箱的正常工作，GSK特異配備發(fā)電設(shè)備，且有專人24 h值班，而且實驗疫苗的來回運輸也是頗費周折。而重組腺病毒載體埃博拉疫苗則可保存在常規(guī)冰箱，來回運輸通過常規(guī)的冷藏箱即可實現(xiàn)，非常便利，受到塞拉利昂藥材局長和衛(wèi)生部長的高度認可。

2 重組腺病毒載體埃博拉疫苗有效克服預(yù)存免疫

以5型腺病毒為載體開發(fā)疫苗，最大的擔(dān)憂就是預(yù)存免疫有可能會影響疫苗的臨床效果；臨床試驗結(jié)果表明增加免疫劑量或者采用加強免疫均可有效避免預(yù)存免疫對埃博拉疫苗免疫效果的影響。

Ⅰ期臨床研究發(fā)現(xiàn)，75%～85%受試者體內(nèi)具有5型腺病毒的中和抗體，而55%～63%受試者體內(nèi)具有更高滴度的腺病毒中和抗體；臨床研究結(jié)果表明，受試者體內(nèi)的腺病毒中和抗體可以減弱疫苗激發(fā)的抗GP糖蛋白特異性的抗體反應(yīng)，但是低劑量組更為明顯；總之，增加免疫劑量可有效避免預(yù)存免疫對埃博拉疫苗的影響[2]。

無論是高劑量組，還是低劑量組，初免受試者體內(nèi)均產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，但是從28天抗GP蛋白抗體滴度達到高峰之后，抗體滴度開始下降，至6月時抗體滴度下降到較低的水平。初免6月后以相同的疫苗和劑量進行加強免疫，結(jié)果表明，無論加強免疫時受試者體內(nèi)抗5型腺病毒中和抗體水平的高低，兩個劑量組，加強免疫后都產(chǎn)生很強的抗GP蛋白的抗體反應(yīng)，抗GP蛋白抗體滴度遠高于初次免疫時的抗體滴度；提示重組埃博拉疫苗通過加強免疫也可有效克服預(yù)存免疫對疫苗的影響[3]。

3 重組腺病毒載體埃博拉疫苗技術(shù)應(yīng)用展望

重組埃博拉病毒載體疫苗采用腺病毒載體技術(shù)，腺病毒載體疫苗既可誘導(dǎo)體液免疫，也可以誘導(dǎo)細胞免疫，無需佐劑，可以通過肌肉注射或者粘膜免疫，是非常理想的疫苗載體。腺病毒載體疫苗廣泛應(yīng)用于各種預(yù)防性和治療性疫苗的開發(fā)，包括艾滋病、流感、塞卡病毒病、乙肝、HPV感染、前列腺癌、丙肝、狂犬病及結(jié)核病的疫苗，是目前最有應(yīng)用前景的疫苗載體之一[4]。

據(jù)saranya Sridhar的統(tǒng)計，截至2015年，有15個不同的埃博拉疫苗處于臨床前藥效學(xué)研究階段，8個疫苗處于不同的臨床階段。這8個處于臨床階段的埃博拉疫苗，除了1個為VLP蛋白疫苗，一個為DNA疫苗外，其余6個均為病毒載體疫苗，其中3個均為腺病毒載體疫苗[5]。

腺病毒作為平臺技術(shù)高表達、易于生產(chǎn)、質(zhì)量可控；公司建立的腺病毒載體平臺技術(shù)可實現(xiàn)應(yīng)急疫苗的快速研發(fā)和制備，該平臺技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于結(jié)核病，馬爾堡和寨卡疫苗的開發(fā)。基于腺病毒載體技術(shù)平臺開發(fā)的重組結(jié)核病疫苗已經(jīng)在加拿大完成臨床I期研究，正在進行粘膜免疫（噴霧給藥）。口服制劑或者粘膜給藥技術(shù)的研發(fā)，包括生物礦化，將極大增強腺病毒平臺技術(shù)的適用性；為更多新型疫苗的開發(fā)提供新的技術(shù)途徑。

參考文獻

[1]李昱,任翔,劉翟,等.埃博拉病毒病流行病學(xué)、生態(tài)學(xué)、診斷、治療及控制[J].科學(xué)導(dǎo)報,2014,32 (24):17-26.

[2]Zhu F C,Hou L H,Chen W,et al.Safety and im?munogenicity of a novel recombinant adenovirus type-5 vector-based Ebola vaccine in healthyadultsin China:preliminary reportofa randomised,doubleblind,placebo-controlled,phase 1 trial[J].Lancet, 2015,385(9984):2272-2279.

[3]Li J X,Hou L H,Chen W,et al.Immunity dura? tion of a recombinant adenovirus type-5 vectorbased Ebola vaccine and a homologous prime-boost immunisation in healthy adults in China:final report ofa randomised,double-blind,placebo-controlled, phase 1 trial[J].Lancet Glob Health,2017,5(3):e324-e334.

[4]楊勇,周東明.腺病毒載體疫苗的臨床研究進展[J].生命的化學(xué),2014,34(1):46-51.

[5]Sridhar S.Clinical development of Ebola vaccine[J].Ther Adv Vaccines,2015,3(5-6):125-138.

（特邀編輯：侯利華）

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.01.003