紫檀芪處理對釀酒酵母基因組表達變化的影響

葉云+付軍鵬+李祎予+鐘英英

摘要：紫檀芪是存在于葡萄等植物中的天然酚類化合物，具有極強的抗真菌活性。然而，目前關于紫檀芪對真菌影響的分子機制仍是未知；因此，本研究以釀酒酵母為模型，比較紫檀芪處理和對照釀酒酵母中的基因表達譜，在基因組水平上探討紫檀芪對真菌細胞的影響。結果表明，經紫檀芪處理能使細胞應激反應、細胞透過性及跨膜運輸等功能的相關基因表達上調，而下調基因則與堿基代謝有關，并參與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，簡稱MAPK）信號通路調控導致細胞衰老、凋亡。這些基因表達的改變，可為探討紫檀芪抑制真菌的分子機制提供一定依據。

關鍵詞：紫檀芪；基因芯片；釀酒酵母；差異基因；基因表達

中圖分類號：Q786文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）05-0044-02

紫檀芪（3，5-二甲氧基-4′-羥基二苯乙烯）廣泛存在于葡萄、廣西血竭和蜂膠中，是目前研究較多的白藜蘆醇天然衍生物[1-3]。紫檀芪的體外抗真菌特性比白藜蘆醇高5～10倍[4]，然而對其抗菌分子機制的相關研究相對較少。本研究分析紫檀芪作用釀酒酵母基因芯片數據，為了解白藜蘆醇處理對真菌基因表達變化的影響，以及為其抗真菌的分子機制提供理論依據。

1材料與方法

1.1基因芯片數據

紫檀芪處理釀酒酵母[WTBX][STBX]S288C[WTBZ][STBZ]細胞基因表達譜GSE10554來源于NCBI的基因表達數據庫（gene expression omnibus，簡稱GEO），本研究采用了3個經紫檀芪處理的釀酒酵母[WTBX][STBX]S288C[WTBZ][STBZ]樣本及3個未處理樣本。該芯片試驗平臺為GPL90，是Affymetrix公司的商業性芯片，共有9 335個不同的酵母轉錄子，包括已知的6 400個酵母基因探針。

1.2數據預處理

芯片數據樣本解壓后放入同一文件夾，將數據導入BRB ArrayTools軟件包，并自動生成試驗描述符文件。利用軟件包中的Filter工具對芯片數據進行過濾和標準化，采用的過濾參數是熒光信號強度大于200；每張芯片采用中位數對整張芯片進行標準化，并對不符合以下標準的基因進行濾除：2類樣本的基因中位數值至少發生2倍的改變，且這種改變不少于20%的樣本數；基因表達數據缺失的樣本數不超過50%。

1.3差異表達基因的篩選

采用2陣列組間非配對樣本t檢驗，找到紫檀芪處理釀酒酵母細胞及未處理細胞中的差異表達基因。篩選標準為 P<0.001，變化倍數大于2，10 000次隨機，假陽性發現率 <0.01。

1.4差異表達基因的功能富集及通路分析

用GOEAST數據庫（http：//omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/index.php）和DAVID（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）在線分析工具分別對上調和下調差異表達基因進行基因功能注釋，了解與這些差異表達基因相關的生物學功能，從而探討紫檀芪作用釀酒酵母的可能分子機制。同時，利用京都基因與基因組百科全書數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，簡稱KEGG）找到與這些差異表達基因相應的生物學通路，以便為紫檀芪對釀酒酵母影響的分子機制提供思路。

2結果與分析

2.1差異表達基因

通過數據預處理，共有654個基因通過了濾過標準，這些基因中進行2樣本非配對t檢驗，共獲得236個有統計學意義的差異表達基因，已知其中的132個基因。這些基因中有77個表達上調，55個表達下調，變化倍數達到5以上的基因有81個，上調基因中變化倍數最大的接近290，變化倍數超過10的有30個基因；表達下調基因中變化最大的則達到120倍，變化倍數超過10的有10個基因。

2.2差異表達基因GOEAST分析結果

用DAVID和GOEAST等2個數據庫對差異表達基因進行功能注釋發現，上調的差異表達基因主要與轉錄調控、熱激反應、壓力反應、細胞膜透過性、ATP酶活力、藥物運輸等生物學功能有關；下調的差異表達基因則主要與有性繁殖、細胞增殖、氨基酸運輸、細胞融合等生物學過程有關。KEGG通路分析發現，下調基因富集在MAPK、嘧啶嘌呤代謝、鞘氨醇的脫氫反應等生物學通路上，

用的分子表達變化情況，為進一步探討紫檀芪作用于真菌的分子機制提供了依據。本研究通過分析經紫檀芪處理釀酒酵母細胞及對照的基因表達譜數據，共獲得132個已知功能的基因，其中77個基因表達上調，55個基因表達下調，表明這些基因的表達變化可能是紫檀芪抑制真菌活性的主要分子基礎。

通過進一步功能注釋發現，上調基因與細胞膜透過性、應激反應等主要生物功能有關。除此之外，表達上調的基因中還有等熱激蛋白家族成員。生物體受到熱激時，熱激蛋白基因轉錄被激活，多數正常蛋白質基因的轉錄被抑制，同時正常溫度下存在的大多數mRNA的翻譯降低或停止。熱激蛋白的上調表達表明，經紫檀芪處理對酵母的生長產生了環境脅迫，使其誘導表達熱激蛋白以抵抗不良環境。

根據KEGG數據庫對差異表達基因進行通路分析發現，下調基因主要參與MAPK、（神經）鞘脂代謝和嘌呤、嘧啶代謝等通路調控，且往往位于通路的上游：在MAPK信號途徑中基因[WTBX][STBX]MF（ALPHA）2、GPAL、SET3和SET4[WTBZ][STBZ]均參與了通路中第1個激酶（調節縮氨酸信息素信號傳導的激酶）的調控，在該途徑中起著關鍵的作用。MAPK是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能響應各種胞外和胞內刺激從而被激活，在多種細胞過程中發揮關鍵性作用，包括細胞增殖、分化和凋亡等[6]。而上述基因的下調表達，使得MAPK活化受到抑制，從而阻止MAPK信號途徑，促使釀酒酵母細胞凋亡。有研究表明，經紫檀芪處理可以抑制脂多糖激活的神經小膠質細胞中的MAPK信號通路[7]。在（神經）鞘脂代謝過程中，基因[WTBX][STBX]TSC10[WTBZ][STBZ]參與催化鞘氨醇的脫氫反應。該反應處于鞘脂代謝的上游，對下游的代謝過程有著非常重要的作用，而該反應所產生的能量也是下游代謝過程中的主要能量來源。經紫檀芪處理后基因[WTBX][STBX]TSC10[WTBZ][STBZ]表達下調了4.17倍，表明紫檀芪對鞘脂代謝過程有較強的抑制作用，而鞘脂普遍存在于各種動植物細胞的細胞膜、細胞器膜、載脂蛋白和富脂器官中，在細胞的胞吞、胞飲等細胞過程中起著重要作用，而且鞘脂代謝途徑中的一些中間體還是重要的信號分子，在細胞信號轉導、細胞抗逆反應以及細胞的生長、凋亡、分化、衰老等細胞基本活動過程中發揮重要的調節作用[8-9]。這些說明了紫檀芪對釀酒酵母細胞生長和分化有抑制作用，從而誘導釀酒酵母細胞的凋亡、衰老。經紫檀芪處理后基因[WTBX][STBX]RNR1[WTBZ][STBZ]下調了7.14倍；另外[WTBX][STBX]POL12、FUR1[WTBZ][STBZ]也分別表達下調了4.00倍。由于這些基因對嘌呤和嘧啶代謝起著關鍵作用，它們表達的下調導致調控的通路過程受到抑制，影響核酸代謝，細胞生長受到抑制。

[HS2*2/3][HT8.5H]參考文獻：

[1]Liu J，Fan C X，Yu L M，et al. Pterostilbene exerts an anti-inflammatory effect via regulating endoplasmic reticulum stress in endothelial cells[J]. Cytokine，2016，77：88-97.

[2]Al R M，Rimando A M，Silistreli K，et al. Anxiolytic action of pterostilbene：involvement of hippocampal ERK phosphorylation[J]. Planta Medica，2013，79（9）：723-730.

[3]McCormack D，McFadden D. Pterostilbene and cancer：current review[J]. Journal of Surgical Research，2012，173（2）：53-61.

[4]王俊芳，李瑞國，劉文，等. 葡萄白藜蘆醇主要衍生物的研究進展[J]. 園藝學報，2011，38（4）：790-798.

[5]郭虹霞，王創云，趙麗，等. 小分子熱激蛋白的研究進展[J]. 山西農業科學，2013，41（12）：1421-1423.

[6]徐偉麗，孫文廣，馬鶯. MAPK信號通路與結直腸癌[J]. 現代腫瘤醫學，2010，18（2）：389-392.

[7]Hou Y，Li N，Xie G B，et al. Pterostilbene exerts anti-neuroinflammatory effect on lipopolysaccharide-activated microglia via inhibition of MAPK signalling pathways[J]. Journal of Functional Foods，2015（19）：676-687.

[8]Dickson R C，Lester R L.Shpingolipid functions in Saccharomyces cerevisiae[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2002，1583（1）：13-25.

[9]Dicksen R C，Sumanasekera C，Lester R L. Functions and metabolism of sphingolipids in Saccharomyces cerevisiae[J]. Progress in Lipid Research，2006，45（6）：447-465.

葉云 付軍鵬 李祎予 鐘英英

摘要：紫檀芪是存在于葡萄等植物中的天然酚類化合物，具有極強的抗真菌活性。然而，目前關于紫檀芪對真菌影響的分子機制仍是未知；因此，本研究以釀酒酵母為模型，比較紫檀芪處理和對照釀酒酵母中的基因表達譜，在基因組水平上探討紫檀芪對真菌細胞的影響。結果表明，經紫檀芪處理能使細胞應激反應、細胞透過性及跨膜運輸等功能的相關基因表達上調，而下調基因則與堿基代謝有關，并參與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，簡稱MAPK）信號通路調控導致細胞衰老、凋亡。這些基因表達的改變，可為探討紫檀芪抑制真菌的分子機制提供一定依據。

關鍵詞：紫檀芪；基因芯片；釀酒酵母；差異基因；基因表達

中圖分類號：Q786文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）05-0044-02

紫檀芪（3，5-二甲氧基-4′-羥基二苯乙烯）廣泛存在于葡萄、廣西血竭和蜂膠中，是目前研究較多的白藜蘆醇天然衍生物[1-3]。紫檀芪的體外抗真菌特性比白藜蘆醇高5～10倍[4]，然而對其抗菌分子機制的相關研究相對較少。本研究分析紫檀芪作用釀酒酵母基因芯片數據，為了解白藜蘆醇處理對真菌基因表達變化的影響，以及為其抗真菌的分子機制提供理論依據。

1材料與方法

1.1基因芯片數據

紫檀芪處理釀酒酵母[WTBX][STBX]S288C[WTBZ][STBZ]細胞基因表達譜GSE10554來源于NCBI的基因表達數據庫（gene expression omnibus，簡稱GEO），本研究采用了3個經紫檀芪處理的釀酒酵母[WTBX][STBX]S288C[WTBZ][STBZ]樣本及3個未處理樣本。該芯片試驗平臺為GPL90，是Affymetrix公司的商業性芯片，共有9 335個不同的酵母轉錄子，包括已知的6 400個酵母基因探針。

1.2數據預處理

芯片數據樣本解壓后放入同一文件夾，將數據導入BRB ArrayTools軟件包，并自動生成試驗描述符文件。利用軟件包中的Filter工具對芯片數據進行過濾和標準化，采用的過濾參數是熒光信號強度大于200；每張芯片采用中位數對整張芯片進行標準化，并對不符合以下標準的基因進行濾除：2類樣本的基因中位數值至少發生2倍的改變，且這種改變不少于20%的樣本數；基因表達數據缺失的樣本數不超過50%。

1.3差異表達基因的篩選

采用2陣列組間非配對樣本t檢驗，找到紫檀芪處理釀酒酵母細胞及未處理細胞中的差異表達基因。篩選標準為 P<0.001，變化倍數大于2，10 000次隨機，假陽性發現率 <0.01。

1.4差異表達基因的功能富集及通路分析

用GOEAST數據庫（http：//omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/index.php）和DAVID（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）在線分析工具分別對上調和下調差異表達基因進行基因功能注釋，了解與這些差異表達基因相關的生物學功能，從而探討紫檀芪作用釀酒酵母的可能分子機制。同時，利用京都基因與基因組百科全書數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，簡稱KEGG）找到與這些差異表達基因相應的生物學通路，以便為紫檀芪對釀酒酵母影響的分子機制提供思路。

2結果與分析

2.1差異表達基因

通過數據預處理，共有654個基因通過了濾過標準，這些基因中進行2樣本非配對t檢驗，共獲得236個有統計學意義的差異表達基因，已知其中的132個基因。這些基因中有77個表達上調，55個表達下調，變化倍數達到5以上的基因有81個，上調基因中變化倍數最大的接近290，變化倍數超過10的有30個基因；表達下調基因中變化最大的則達到120倍，變化倍數超過10的有10個基因。

2.2差異表達基因GOEAST分析結果

用DAVID和GOEAST等2個數據庫對差異表達基因進行功能注釋發現，上調的差異表達基因主要與轉錄調控、熱激反應、壓力反應、細胞膜透過性、ATP酶活力、藥物運輸等生物學功能有關；下調的差異表達基因則主要與有性繁殖、細胞增殖、氨基酸運輸、細胞融合等生物學過程有關。KEGG通路分析發現，下調基因富集在MAPK、嘧啶嘌呤代謝、鞘氨醇的脫氫反應等生物學通路上，

用的分子表達變化情況，為進一步探討紫檀芪作用于真菌的分子機制提供了依據。本研究通過分析經紫檀芪處理釀酒酵母細胞及對照的基因表達譜數據，共獲得132個已知功能的基因，其中77個基因表達上調，55個基因表達下調，表明這些基因的表達變化可能是紫檀芪抑制真菌活性的主要分子基礎。

通過進一步功能注釋發現，上調基因與細胞膜透過性、應激反應等主要生物功能有關。除此之外，表達上調的基因中還有等熱激蛋白家族成員。生物體受到熱激時，熱激蛋白基因轉錄被激活，多數正常蛋白質基因的轉錄被抑制，同時正常溫度下存在的大多數mRNA的翻譯降低或停止。熱激蛋白的上調表達表明，經紫檀芪處理對酵母的生長產生了環境脅迫，使其誘導表達熱激蛋白以抵抗不良環境。

根據KEGG數據庫對差異表達基因進行通路分析發現，下調基因主要參與MAPK、（神經）鞘脂代謝和嘌呤、嘧啶代謝等通路調控，且往往位于通路的上游：在MAPK信號途徑中基因[WTBX][STBX]MF（ALPHA）2、GPAL、SET3和SET4[WTBZ][STBZ]均參與了通路中第1個激酶（調節縮氨酸信息素信號傳導的激酶）的調控，在該途徑中起著關鍵的作用。MAPK是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能響應各種胞外和胞內刺激從而被激活，在多種細胞過程中發揮關鍵性作用，包括細胞增殖、分化和凋亡等[6]。而上述基因的下調表達，使得MAPK活化受到抑制，從而阻止MAPK信號途徑，促使釀酒酵母細胞凋亡。有研究表明，經紫檀芪處理可以抑制脂多糖激活的神經小膠質細胞中的MAPK信號通路[7]。在（神經）鞘脂代謝過程中，基因[WTBX][STBX]TSC10[WTBZ][STBZ]參與催化鞘氨醇的脫氫反應。該反應處于鞘脂代謝的上游，對下游的代謝過程有著非常重要的作用，而該反應所產生的能量也是下游代謝過程中的主要能量來源。經紫檀芪處理后基因[WTBX][STBX]TSC10[WTBZ][STBZ]表達下調了4.17倍，表明紫檀芪對鞘脂代謝過程有較強的抑制作用，而鞘脂普遍存在于各種動植物細胞的細胞膜、細胞器膜、載脂蛋白和富脂器官中，在細胞的胞吞、胞飲等細胞過程中起著重要作用，而且鞘脂代謝途徑中的一些中間體還是重要的信號分子，在細胞信號轉導、細胞抗逆反應以及細胞的生長、凋亡、分化、衰老等細胞基本活動過程中發揮重要的調節作用[8-9]。這些說明了紫檀芪對釀酒酵母細胞生長和分化有抑制作用，從而誘導釀酒酵母細胞的凋亡、衰老。經紫檀芪處理后基因[WTBX][STBX]RNR1[WTBZ][STBZ]下調了7.14倍；另外[WTBX][STBX]POL12、FUR1[WTBZ][STBZ]也分別表達下調了4.00倍。由于這些基因對嘌呤和嘧啶代謝起著關鍵作用，它們表達的下調導致調控的通路過程受到抑制，影響核酸代謝，細胞生長受到抑制。

[HS2*2/3][HT8.5H]參考文獻：

[1]Liu J，Fan C X，Yu L M，et al. Pterostilbene exerts an anti-inflammatory effect via regulating endoplasmic reticulum stress in endothelial cells[J]. Cytokine，2016，77：88-97.

[2]Al R M，Rimando A M，Silistreli K，et al. Anxiolytic action of pterostilbene：involvement of hippocampal ERK phosphorylation[J]. Planta Medica，2013，79（9）：723-730.

[3]McCormack D，McFadden D. Pterostilbene and cancer：current review[J]. Journal of Surgical Research，2012，173（2）：53-61.

[4]王俊芳，李瑞國，劉文，等. 葡萄白藜蘆醇主要衍生物的研究進展[J]. 園藝學報，2011，38（4）：790-798.

[5]郭虹霞，王創云，趙麗，等. 小分子熱激蛋白的研究進展[J]. 山西農業科學，2013，41（12）：1421-1423.

[6]徐偉麗，孫文廣，馬鶯. MAPK信號通路與結直腸癌[J]. 現代腫瘤醫學，2010，18（2）：389-392.

[7]Hou Y，Li N，Xie G B，et al. Pterostilbene exerts anti-neuroinflammatory effect on lipopolysaccharide-activated microglia via inhibition of MAPK signalling pathways[J]. Journal of Functional Foods，2015（19）：676-687.

[8]Dickson R C，Lester R L.Shpingolipid functions in Saccharomyces cerevisiae[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2002，1583（1）：13-25.

[9]Dicksen R C，Sumanasekera C，Lester R L. Functions and metabolism of sphingolipids in Saccharomyces cerevisiae[J]. Progress in Lipid Research，2006，45（6）：447-465.