甲基睪酮對雌斑馬魚內分泌干擾效應的研究

侯麗萍，何駿駒，馮子懿，鄭 果，梁藝聰，方少彬

（廣州大學生命科學學院，廣東 廣州 510006）

甲基睪酮對雌斑馬魚內分泌干擾效應的研究

侯麗萍，何駿駒，馮子懿，鄭 果，梁藝聰，方少彬

（廣州大學生命科學學院，廣東 廣州 510006）

甲基睪酮（MT）廣泛存在于造紙廢水中，為了研究其對水生動物內分泌的干擾效應，選用斑馬魚為模式生物，開展甲基睪酮對斑馬魚的慢性毒性暴露實驗。將雌性斑馬魚分別暴露在含 10、50、100 和 150 μg/L 的甲基睪酮水環境中 48 d，另設空白對照和 0.01% 甲醇對照，觀察斑馬魚的個體生長指標及組織結構的變化。結果表明：當 MT 濃度為 150 μg/L 時，斑馬魚全部死亡；而在 0～100 μg/L 的 MT 暴露處理中，隨著MT濃度的增加，斑馬魚的體重逐漸減輕，體長逐漸縮短，臀鰭逐漸變大，體色轉向偏黃，出現了雄性化的特征；而且肝臟和性腺重量均明顯減輕，卵巢出現明顯的退化特征，肝細胞逐漸腫大，細胞核偏移中央，且伴隨細胞中空等現象；其中，50 和 100 μg/L MT 處理的斑馬魚鰓絲變得高低不一，有的開始斷裂甚至結構無法辨認。

斑馬魚；環境激素；甲基睪酮；毒理作用

近年來，隨市場需求的不斷增長，激素因見效快、輻射廣、周期短及獲取途徑多等優點在養殖業被廣泛使用。某些商家為了快速牟利，便將激素混入飼料中喂養畜禽，讓畜禽畸形生長，使其適應市場需求。這種做法不僅會使牲畜內分泌系統失調，各器官出現畸形化病變，殘留的激素還可能流入周圍環境禍害當地的其他動物，破壞生態平衡。在激素使用中，環境激素的使用最為廣泛。

環境激素又稱內分泌干擾物（Endocrine disruptors chemicals，EDCs），因分子結構與天然荷爾蒙相似，故易與激素受體結合，影響動物內分泌系統，導致動物多種機能如生育和神經機能不能正常運作[1-2]。其中運用最多的就是雄性激素。

雄激素能將雌性動物雄性化，使其擁有部分雄性動物的體征，在養殖水環境中添加一定量的雄激素如雄 烯 二 酮（4-androstene-3,17-dine，ADSD） 或 甲 基 睪酮（17 a-methyltestosterone，MT）可使雌魚肉質更緊湊，魚類生長速度加快，生長周期縮短，但其會損害魚類如日本鰻鱺和劍尾魚等水生動物的器官功能，并影響激素正常分泌，導致肝臟和性腺等出現病變[3-5]，甚至死亡。而死亡個體又會分泌出環境激素繼續污染環境，毒害其他水生動物，影響自然狀態下物種的性別比例。各國對環境激素風險評估結果表明，環境激素對各脊椎動物長期侵染有巨大危害[6]，但不同濃度甲基睪酮對魚類的影響并非呈絕對正相關或負相關[7-8]。

雄激素中 17 α- 甲基睪酮（MT）一般由人工合成，因其合成簡單、效果明顯，被廣泛用于各個領域。MT能促進日本鰻鱺、羅非魚及鯽魚生長，還可讓雌性的魚雄性化，產生精子[9]，甚至可使雌性赤點石斑變成功能性雄魚與雌魚交配[10]。但在各國的風險評估報告中，MT對人類危害的評估幾乎為空白。因此，以基因與人類相似性達 85% 的斑馬魚[11]為材料，利用不同濃度 MT 進行為期 48 d 的暴露試驗，觀察斑馬魚的各項生長指標和組織結構的變化，進而分析判斷MT對斑馬魚的病理學作用，由此推斷MT對人類生理的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以基因與人類相似性達 85% 的斑馬魚[11]為材料（購自芳村花鳥魚市場），體長均為 4～5 cm，體重均為 0.7～0.9 g，魚齡相當于成體斑馬魚，以紅蟲為餌料。在實驗室馴養至不再出現死亡個體則開始暴露試驗。

試驗主要試劑有甲基睪酮、0.01% 甲醇、70% 乙醇、Bouin 氏液等。暴露容器為 25 cm×20 cm×20 cm的方形玻璃缸。

1.2 試驗方法

1.2.1 MT 暴露處理 MT 溶液設置 4 個濃度，分別為 10、50、100 和 150 μg/L，另設空白對照（CK1）與 0.01%甲醇對照（CK2）。每個處理放入 30 條魚齡相當、大小相似的雌性斑馬魚。連續暴露 48 d，期間每隔 24 h換水一次，每次換總水量的 1/3。

1.2.2 形態學實驗數據采集 暴露 48 d 后斑馬魚深埋冰里致死，記錄魚的長度及體重，把臀鰭切下在解剖鏡下觀察臀鰭數。

1.2.3 組織切片制作 斑馬魚冰處死后，取出其腮、肝、性腺，用 Bouin 液、乙醇、二甲苯等制作石蠟切片，切片進行EH染色。

1.3 數據處理與分析

試 驗數據采 用 SPSS 軟 件進行 分 析，并 用單因素方差分析（ANOVA） 來檢驗不同濃度組斑馬魚各生理指標的差異，用 LSD 對結果進行驗后多重比較。P<0.05，則認為有顯著性統計意義。

2 結果與分析

2.1 不同濃度甲基睪酮暴露對雌斑馬魚生長發育的影響

試驗結果顯示，不同濃度的MT暴露處理，對斑馬魚均產生了一定毒性作用，其中，150 μg/L 的處理斑馬魚全部死亡。由圖 1～ 圖6 可知，經過 48 d 的MT 暴露，在 0～100 μg/L 濃度范圍內，斑馬魚的身長、臀鰭條數、鰓重、肝臟重及性腺重的數值均隨濃度的升高而減少，但并未表現出顯著性變化；而魚體重在10、50 和 100 μg/L 的 MT 暴露 下 表 現出極顯著減少（P<0.01）。總的來說，斑馬魚隨著甲基睪酮濃度增加，體重、體長逐漸減低，外觀上臀鰭變大，體色逐漸偏黃，出現雄性化特征。

2.2 不同濃度甲基睪酮暴露對雌斑馬魚組織細胞的影響

圖1 甲基睪酮暴露對雌斑馬魚體長的影響

圖2 甲基睪酮暴露對雌斑馬魚體重的影響[（圖中 ** 表示各處理與對照差異達極顯著水平（P ＜ 0.01）]

圖3 甲基睪酮暴露對雌斑馬魚臀鰭條數的影響

圖4 甲基睪酮暴露對雌斑馬魚鰓重的影響

圖5 甲基睪酮暴露對雌斑馬魚肝重的影響

圖6 甲基睪酮暴露對雌斑馬魚性腺重的影響

2.2.1 性腺組織切片觀察 如圖 7A 和 B 所示，空白對照和甲醇對照處理的斑馬魚，卵巢表現正常，卵母細胞間排列緊密，包含了5個時期卵母細胞，成熟卵母細胞豐富 ；10 μg/L 甲基睪酮暴露處理后，斑馬魚卵巢中Ⅲ期以上成熟卵母細胞數目減少（圖 7C），50 μg/L 處理組卵母細胞之間排列開始出現明顯松散現象，成熟卵期的卵母細胞發生了變形腫脹，出現了退化的卵母細胞（圖 7D）；100 μg/L 處理組中卵母細胞排列松散，細胞變形嚴重，表明卵母細胞退化加重，圖中Ⅱ、Ⅲ期細胞占大多數，基本沒有Ⅴ期成熟的卵母細胞（圖 7E）。

2.2.2 肝組織切片觀察 如圖8 F 和 G 所示，空白對照與甲醇對照處理的斑馬魚，肝細胞緊密排列，細胞清晰胞質均勻，細胞核于細胞中心，細胞相對較小；10 μg/L 甲基睪酮暴露處理后，斑馬魚肝細胞腫大，細胞核偏移中央，細胞出現中空現象，細胞脂質化逐

漸加深（圖 8H）；50 和 100 μg/L 處理組，肝細胞的空泡結構尤為嚴重，出現核固縮現象，細胞腫大較嚴重（圖8 I、J）。

2.2.3 鰓絲切片觀察 如圖 9K、L 所示，空白對照與甲醇對照處理的斑馬魚，鰓絲排列整齊緊密，均勻細長 ；10 μg/L 甲基睪酮暴露處理后，斑馬魚腮絲排列變得松散且高低不一（圖 9N）；隨著甲基睪酮濃度的升高，鰓絲結構退化越來越嚴重，50 μg/L 處理的腮絲出現斷裂，排列非常不整齊，腮絲變得粗短，結構開始模糊（圖 9M）；100 μg/L 處理的鰓絲結構退化尤為嚴重，很多部分已無法辨認（圖 9O）。

3 討 論

圖7 不同濃度甲基睪酮暴露 48 d 后雌斑馬魚卵巢組織的變化（A：空白對照，正常卵巢；B：甲醇對照，卵巢無明顯變化；C：10 μg/L 處理，卵巢中成熟卵母細胞數目減少；D：50 μg/L 處理，卵巢細胞排列疏松；E：100 μg/L處理，卵巢中Ⅱ、Ⅲ期細胞占絕大多數）

圖8 不同濃度甲基睪酮暴露 48 d 后雌斑馬魚肝臟組織的變化（F：空白對照，正常肝臟細胞；G：甲醇對照；H：10 μg/L 處理，肝臟細胞出現腫大；I：50 μg/L 處理；J：100 μg/L 處理，空泡結構嚴重，出現核固縮）

圖9 不同濃度甲基睪酮暴露 48 d 后雌斑馬魚鰓組織的變化（K：空白對照，正常鰓絲結構；L：甲醇對照；N：10 μg/L 處理，鰓絲結構排列松散；M：50 μg/L 處理，鰓絲結構排列不整齊，鰓絲粗短；O：100 μg/L 處理，鰓絲結構部分已無法辨認）

參考前人[12-13]的方法，對斑馬魚各指標間的相關性進行線性回歸分析，結果顯示，在試驗選取的MT 濃度范圍中，10 和 50 μg/L 的 MT 濃度處理，斑馬魚的體重發生了顯著性變化，而其他試驗指標在各濃度處理的差異均未達到顯著性水平。綜合切片分析，造成這一結果的原因有二：一是試驗所采取的MT最低濃度已超出顯著性變化范圍，所以更高濃度對斑馬魚除體重指標外的其他指標的影響升幅不明顯；二是此次試驗MT最高濃度沒達到顯著性變化濃度。因此，仍需擴大試驗濃度范圍或縮小濃度區間作進一步研究。

試驗中，隨著MT濃度的增加，斑馬魚的體重逐漸減輕，體長逐漸縮短，臀鰭逐漸變大，體色轉向偏黃，出現了雄性化的特征。尤其是在高濃度MT作用下，雄性化特征逐漸明顯。石蠟切片觀察顯示，隨著MT濃度的增加，斑馬魚的肝臟、性腺和腮的重量均明顯減輕，且卵巢出現明顯的退化特征。這與趙春剛等[14]的研究結果相似；肝細胞逐漸腫大，細胞核偏移中央，且伴隨細胞中空、細胞脂質化加深等現象；其中，50和 100 μg/L MT 處理的斑馬魚鰓絲變得高低不一，有的開始斷裂甚至結構無法辨認。

研究表明，甲基睪酮對魚類轉雄效應較顯著，其中包括鮭點石斑魚[15]、黃腹石斑魚[16]等多種石斑魚，食蚊魚[17]和劍尾魚。該試驗也證實了外源激素甲基睪酮的長期暴露可使雌魚斑馬魚趨向雄性化發育，而且多種器官出現病理性損害。因此，加強對環境中外源性激素的評估及其對人類等哺乳動物影響的研究十分必要。

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（責任編輯：成 平）

Endocrine Disruption of Methyltestosterone on Zebra Fish

HOU Li-ping，HE Jun-ju，FENG Zi-yi，ZHENG Guo，LIANG Yi-cong，FANG Shao-bin
（School of Life Science, Guangzhou University, Guangzhou 510006, PRC）

Methyltestosterone is widely present in papermaking wastewater drainage. In order to study endocrine disrupting effects it produces, this paper used zebra fi sh as model organism to conduct methyltestosterone zebra fi sh exposed to chronic toxicity experiments. The female Zebra fi sh were exposed to the water environment with 0, 10, 50, 100 and 150 μg/L methyl testosterone in 48 days and no MT group and 0.01% methanol group used as control group, to record their growth indicators changes and tissue damaged. The results showed that exposure to 150 μg/L MT Zebra fi sh all died. In other groups, with the growth of concentration, various indicators have been changed. MT has tiggered some symptoms to treated group zebra fi sh, such as oval cells degenerated; hepatocyte tumefaction, vacuolation and nuclear offseted. Besides that, in 50 and 100μg/L MT groups, fish fin filgaments showed uneven, some of them even broken or unrecognized.

Zebra fi sh; environmental hormone; methyl testosterone; toxicological effects

S917.4

A

1006-060X（2017）03-0070-04

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.003.020

2016-09-26

汕頭大學開放基金（GPKLMB201603）

侯麗萍（1977-），女，廣東樂昌縣人，講師，主要從事生態毒理學研究。