龍牙百合種球鱗片無菌快繁技術研究

肖 珂，王夢希，胡勝男，彭國平

（1.湖南農業大學東方科技學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學生物科學院，湖南 長沙 410128）

龍牙百合種球鱗片無菌快繁技術研究

肖 珂1，王夢希1，胡勝男1，彭國平2

（1.湖南農業大學東方科技學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學生物科學院，湖南 長沙 410128）

以龍牙百合鱗片為材料，對其組織培養中的關鍵技術進行了研究。結果表明：百合鱗片組織培養最適表面消毒方法為 75% 乙醇擦洗 3 min+0.1% 氯化汞浸泡 13 min；最佳誘導培養基配方為 MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L；最佳擴繁培養基配方為 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L；最佳生根培養基配方為 1/2MS+NAA 0.10 mg/L。

龍牙百合；鱗片；消毒滅菌；組織培養

龍牙百合 L.brownii（F.E.Brown ex Mille）var.viridulum Baker是百合的優良品種，產量高、品質好，因鱗片片形似龍牙而得名，是市場上最受歡迎的百合商品之一。實際生產中，龍牙百合病害極為嚴重，常引起大面積、規模性的死苗，導致減產甚至無收[1]。百合病害爆發的原因主要有 ：（1）百合長期進行無性繁殖，病菌通過種球代代相傳 ；（2）百合同時受土傳病害、空氣傳播病害、昆蟲傳播病害的危害，病害種類多，侵染嚴重。筆者通過組培技術，去除種球所帶的病原微生物，獲得無病毒、無細菌、無真菌的種球，以期為龍牙百合安全生產和農戶效益提高提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料及試劑 供試材料為新鮮龍牙百合，來自懷化市中方縣瀘陽鎮龍牙百合生產基地，從沙床中取出新鮮龍牙百合，去除部分染病的百合鱗片后洗凈平攤開，待其表面水珠瀝干后備用。供試試劑有無水乙醇（分析純）、氯化汞（分析純）、84 消毒液、MS 干粉、蔗糖（分析純）、瓊脂粉、6-芐氨基嘌呤（分析純）、萘乙酸（分析純）。

1.1.2 儀器設備 FA2104N 型電子天平（上海菁海儀器有限公司）、潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）、高壓滅菌器（德國 DAIHAN Sdentifi c 有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 消 毒 按表1 的方案分別進行消毒處理，消毒后百合鱗片用蒸餾水清洗 3 次 ；將鱗片切成 1 cm2左右的小片，接入MS培養基中，每個處理接種20塊小片（下同）[2]，觀察記錄百合鱗片的生長狀態。

1.2.2 愈傷組織誘導培養基的優化 為誘導百合鱗片形成愈傷組織，在 MS 培養基中加入 6-BA、2,4-D 兩種激素，為確定誘導百合鱗片的最適激素濃度，設置6 個不同濃度梯度（表 2）[3]，觀察記錄培養基中百合鱗片的生長狀態。

1.2.3 小鱗球增殖培養基的優化 在小鱗球增殖培養基（MS 培養基）中同時使用 6-BA、NAA 兩種激素，能較好的促使百合小種球增殖[4-5]。為研究百合小種球鱗莖生長的最適激素濃度，設置了5種不同濃度梯度（表 3），觀察記錄培養基中小鱗球的生長狀態。

表1 百合鱗片消毒方案

表2 愈傷組織誘導培養基激素濃度設計

表3 小鱗球的增殖培養基激素濃度

1.2.4 小鱗球生根培養基的優化 在小鱗球增殖培養基中添加激素 NAA，能較好地促使百合小種球生根[4-5]。為研究百合小種球鱗莖生根的最適激素濃度，分別在1/2MS 培 養 基 中 添 加 0.03、0.06、0.10、0.13 和 0.16 mg/L 的 NAA，觀察記錄小鱗球的生根狀態。

2 結果與分析

2.1 消毒試劑對百合鱗片組織培養的影響

從表4中可以看出，單獨使用一種消毒劑消毒，滅菌效果都不理想，處理 1～6 的雜菌感染率都在 40%及以上，且誘導出芽的塊數較少，僅 10～17個，這表明氯化汞和84消毒液單獨作為消毒劑時，控菌能力較差，且在試驗設計的處理時間內對百合鱗片有較大的傷害。而采用 75% 乙醇 + 氯化汞的消毒處理，能有效控制培養過程中雜菌生長，處理 7～15的雜菌感染率均不超過 10%，最低可至 3% ；但是如果處理時間過長，也會對百合鱗片造成傷害，如處理 14～15 的發芽數顯著低于處理 7～13。綜合考慮，百合鱗片組織培養的最適消毒方法為 ：75% 乙醇擦洗 3min+0.1%氯化汞浸泡 13 min（處理 10），其雜菌感染率為 5%，發芽率可達 100%。

2.2 培養基優化結構

表4 不同消毒處理對百合鱗片組織培養的影響

2.2.1 誘導培養基 由表5 可知，添加 6-BA 和 2,4-D后愈傷組織誘導率達 100%。當 6-BA 添加濃度為 0.2 mg/L 時，愈傷組織數隨著 2,4-D 濃度的增加而上升 ；而當 6-BA 添加濃度為 0.4 mg/L 時，愈傷組織數隨著2,4-D 濃度的增加而下降。其中，以 MS+6-BA 0.2 mg/ L+2,4-D 2.0 mg/L 的激素水平，百合鱗片的愈傷組織誘導率達 100%，且愈傷組織個數最多。

表5 不同激素水平下百合鱗片愈傷組織誘導情況的比較

2.2.2 增殖培養基 由表6 可知，5 個濃度梯度中，以濃度梯度3的百合小鱗球增殖最多，增值率為100%。故增殖培養基中的最適激素濃度為 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.5 mg/L。

表6 不同激素水平下百合小鱗球增殖情況的比較

2.2.3 生根培養基 由表7 可知，添加 NAA 后，生根率達 100%。當 NAA 濃度過低或過高時，誘導產生不定根的效率都不高，當 NAA 濃度為 0.10 mg/L 時，不定根數量達到峰值，單株生根數達 5.4 根。故生根培養基中 NAA 的最適添加濃度為 0.10 mg/L。

表7 不同激素水平下百合小鱗球生根情況的比較

3 結論與討論

外植體進行組織培養前，必須經過消毒處理，而消毒試劑的選擇和消毒時間的控制均會影響愈傷組織的誘導。由于外植體結構和屬性不同，各種材料對消毒試劑都有不同反應。例如石云平等[6]以頂芽和葉片為外植體時，用 10% 漂白粉溶液處理 10 min 進行消毒。還有研究，用濃度為 20.0 g/L 的次氯酸鈉溶液浸泡 10 min，滅菌時不斷搖動進行外植體消毒。對百合鱗片來講，消毒劑的濃度不能過高，處理時間也不能過長。試驗分別采用了氯化汞浸泡法、84消毒液浸泡法、乙醇擦洗+氯化汞浸泡法進行消毒試驗，確定了龍牙百合鱗片組織培養前最適消毒方法為 75% 乙醇擦洗 3 min+0.1% 氯化汞浸泡 13 min，其雜菌感染率為 5%，發芽率可達 100.00%。采用該方法誘導出的愈傷組織不用進一步消毒，可直接進行繼代培養。

在龍牙百合的組織培養過程中，各階段的培養基所用激素水平不同。在實際生產中，組培苗生長發育的每個階段選取最適培養基配方，可以使效益最大化[7]。試驗結果表明，誘導百合鱗片愈傷組織的最佳培養基配方為 MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L。在小鱗球的增殖培養基中同時使用 6-BA、NAA 2 種激素，能較好地促使百合小鱗球增殖，但要注意2種激素的濃度平衡，如果某種激素濃度過高會適得其反，甚至使小鱗球死亡，濃度過低又會導致百合小鱗球無法擴增。該試驗得出百合小鱗球增殖擴繁的最佳培養基配方為MS+ 6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L。NAA 是促進植物根系生長的植物生長調節劑，但不同植物生根所需的濃度不一致，試驗結果表明百合小鱗球生根培養的最佳培養基配方為 ：1/2 MS + NAA 0.1 mg/L。

[1]蔣細旺，司懷軍 . 百合的組織培養技術綜述 [J]. 湖北農業科學，2004，（1）：78-82.

[2]陳世昌，徐明輝 . 植物組織培養 [M]. 重慶 ：重慶大學出版社，2016.

[3]楊柏云，楊慧琴，蔡奇英，等 . 龍牙百合體細胞胚的誘導及植株再生 [J]. 南昌大學學報（理科版），2005，（6）：536-539.

[4]劉清波，廖兵輝，蔣建雄，等 . 龍牙百合鱗球增重及生根培養研究 [J].湖南農業大學學報（自然科學版），2006，（4）：375-377.

[5]石云平，楊美純，李 鋒 . 龍牙百合生根·結鱗莖培養基的優化 [J].安徽農業科學，2010，38（32）：18121-18125.

[6]石 云 平 . 龍 牙 百 合 組 織 培 養 的 優 化 研 究 [D]. 廣 西 ：廣 西 大 學，2008.

[7]金亞征，俞鳳芳，車瑞香，等 . 藥用百合組織培養快繁技術研究 [J].經濟林研究，2013，31（1）：145-148.

（責任編輯：成 平）

Rapid Propagation Technology of Aseptic Longya Lilium Bulb Scales

XIAO Ke1，WANG Meng-xi1，HU Sheng-nan1，PENG Guo-ping2
（1. College of Oriental Institute of Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Taking Longya lilium bulb scales as materials, the key technique of tissue culture were studied. The result showed that the best disinfection method is scrub it with ethanol of 75% then steeped in mercuric chloride of 0.1 percent. When culture the Longya lily, optimize culture medium in each stage, there come to a conclusion that the culture medium of inducing callus of bulb scales is MS + 2,4-D 2mg/L+ 6BA 0.2mg/L, the culture medium of bulb rapid propagation is MS + BA0.5mg/L + NAA 0.5mg/L, the culture medium of take roots is 1/2MS + NAA 0.1mg/L.

Longya lilium; bulb scales; sterilization; tissue culture

Q945.52

A

1006-060X（2017）03-0007-03

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.003.003

2016-12-19

湖南農業大學東方科技學院大學生研究性學習和創新性實驗計劃項目（DFCXY201455）

肖 珂（1996-），女，湖南隆回縣人，本科生，專業生物技術。