1株大分子有機物降解菌的分離、鑒定及酶學分析

杜東霞+汪彬

摘要：通過平板培養法從高溫堆肥中分離篩選出1株高溫高效大分子有機物降解菌W-10。W-10具有同時分解纖維素、蛋白質和淀粉等大分子有機物的能力。該菌株的生長特性表明，在pH值為5.0、溫度為50 ℃時，羧甲基纖維素酶（CMCase）、蛋白酶、α-淀粉酶的酶活性達到最高值，分別為144.75、97.51、83.85 U/mL。將測得的16S rDNA基因序列在NCBI數據庫中進行同源性比對，綜合形態特征和16S rDNA基因序列同源性分析，將該菌株初步鑒定為芽孢桿菌屬。

關鍵詞：高溫堆肥；大分子有機物；芽孢桿菌屬；W-10

中圖分類號： X172文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0268-03

我國是農業大國，年產各類秸稈約8.0億t，占世界秸稈總量的1/5左右。這些秸稈除了一部分用于飼料、造紙、紡織和燃料加工外，其余均作為農業廢棄物丟棄或就地焚燒，不僅浪費了寶貴的資源，同時也污染了生存環境[1-2]。

通過高溫堆肥降解農業廢棄物是資源化利用的良好途徑之一。高溫堆肥是一種利用各種微生物高溫高效降解有機廢棄物，并產生穩定的最終產物的過程。高溫堆肥可有效促進纖維素廢棄物的資源化利用，并降低農業廢棄物對環境的污染。在堆肥發酵過程中，為縮短發酵周期及提高堆肥質量，以人為方式添加一些高溫微生物，高溫微生物產生的熱穩定酶可將基質中的纖維素及木質素分解，并產生大量的能量和熱量，不僅可以將農業廢棄物轉化為有機肥，而且可以有效抑制堆肥中有害病原菌的孶生。在堆肥基質中，除了纖維素外，還有其他蛋白質及糖類的存在，應深入研究并充分利用高溫微生物對纖維素、蛋白質及糖類等大分子有機物的降解作用，加速農業廢棄物轉化為有機肥。因此，開展堆肥高溫微生物的研究具有重要的意義[3-5]。

[JP2]本研究從堆肥中篩選出能夠高效降解纖維素、蛋白質和淀粉的高溫菌株，并對其酶活性進行測定，目的在于為高效降解大分子有機物菌株的選育和相關酶制劑開發提供菌種資源。[JP]

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1樣品采集

豬糞、城市生活垃圾及秸稈自然堆肥，堆體溫度上升到55 ℃時，采集中層樣品于無菌器皿中，4 ℃保存備用。

1.1.2培養基

（1）分離初篩培養基：牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，水1.0 L，pH值為7.2～7.4。

（2）大分子有機物降解復篩培養基.

羥甲基纖維素鈉培養基（CMC-Na培養基）：CMC-Na 15 g/L、（NH4）2SO4 2.0 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 01 g/L、NaCl 6.0 g/L、CaCl2 0.1 g/L，固體培養基加1.5%瓊脂，加蒸餾水補至1 L、pH值為7.0～7.5，壓力為 1.05 kg/cm2、滅菌25 min。

（3）剛果紅纖維素鑒定培養基。（NH4）2SO4 0.2%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、NaCl 0.05%、CMC-Na 2%、剛果紅0.02%、瓊脂2%、pH值自然。

1.1.3主要儀器試劑

DNA Marker[寶生物工程（大連）有限公司]；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]；Taq聚合酶[寶生物工程（大連）有限公司]；PCR儀（Mastercyclerpro）（Eppendorf公司）；Gel Doc XR凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2試驗方法

1.2.1菌種篩選

（1）菌種的分離與初篩。

[JP2]采取樣品經剪碎、研細后，稱取1 g放入裝有99 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，180 r/min振蕩30 min，靜置；用移液管吸取1 mL上清液于含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，振蕩均勻后，梯度稀釋到10-3～10-7，吸取0.3 mL后3個稀釋度的試樣涂布于羥甲基纖維素鈉平板培養基上，在50 ℃條件下可生長的菌落即具有纖維素分解酶能力，再從中挑選出菌落進行進一步劃線分離。[JP]

（2）菌種的復篩。將具有纖維素分解酶能力的菌株涂布于剛果紅初篩培養基上，經72 h培養，分別測定水解圈直徑（D）和菌落直徑（d），并計算D/d值（即HC值）。挑取生長速度快且HC值大的菌株，再將HC值大的菌株接種于液體發酵培養基中，30 ℃、120 r/min 振蕩培養72 h，3 000 r/min離心10 min，收集上清液即粗酶液，測CMC酶活性，選出CMC酶活性高產菌株，作為復篩菌株。

1.2.2酶活的測定方法

羧甲基纖維素酶（CMC酶，簡稱CMCase）活性的測定：

參照文獻[6]略作改進，1 mL 用 0.1 mol/L pH值為4.8的檸檬酸緩沖液配制的質量分數為1%的CMC-Na溶液，加入0.5 mL適當稀釋的酶液，于50 ℃反應30 min后，加入1.5 mL二硝基水楊酸（DNS）試劑終止反應，沸水浴中煮沸5 min，稀釋定容至25 mL，在530 nm下測定吸光度，按DNS法測定糖濃度。1個酶活性單位（IU）定義為1 min催化底物水解生成1 μg葡萄糖所需的酶量。以100 ℃水浴中滅活10 min的粗酶液為空白對照。

微晶纖維素酶活性測定：

吸取1.0 mL 10 g/L微晶纖維素懸浮液（稱取1.000 g微晶纖維素，加0.05 mol/L pH值為48檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解，稀釋定容至100 mL）和0.5 mL適當稀釋的酶液，50 ℃保溫1 h，離心后，取1.0 mL上清液用DNS法測還原糖生成量[7]。

β-葡萄糖苷酶活性測定：

取0.1 mL適當稀釋的酶液，加入到1 mL 1%水楊酸溶液中（以0.05 mol/L pH值為5.0檸檬酸緩沖液配制），50 ℃恒溫水浴中酶解30 min，DNS法測定還原糖濃度[8]。

α-淀粉酶活性測定：

吸取1 mL 10 g/L可溶性淀粉（稱取1.000 g淀粉溶于100 mL 0.1 mol/L pH值為5.6檸檬酸緩沖液中），0.5 mL酶液，DNS法測定麥芽糖生成量。酶活性定義為1 g干曲1 min內轉化底物生成的麥芽糖毫克數，即 mg/（g·min）[7]。

蛋白質酶活性測定：

采用Folin-酚法[9-10]測定蛋白酶的活性。酶活定義：1 mL 酶液在一定pH值和溫度下，1 min水解酪蛋白產生 1 μg 酪氨酸的酶量為1個酶活性單位（U/mL）。[JP]

1.2.3菌種鑒定

形態鑒定：

將純化的細菌劃線接種于牛肉膏-蛋白胨培養基上，50 ℃ 培養72 h，觀察菌落形態、大小、顏色、表面及邊緣等特征。采用革蘭氏染色和芽孢染色，并在光學顯微鏡下觀察細胞形狀、芽孢及著生特點。

分子鑒定：

提取DNA后，對16S rDNA目的片斷進行PCR擴增[11]。引物序列：F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反應體系（50 μL）：去離子水39 μL，PCR buffer 5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。序列輸入GenBank數據庫中比對，選擇同源性高的序列使用MEGA 5.2軟件鄰接法構建系統發育樹。

2結果與分析

2.1W-10的分離和初步鑒定

試驗分離得到大量具有較好纖維素分解能力的細菌、真菌和放線菌類菌株，其中W-10為1株生長較快且具有較高纖維素分解能力的細菌菌株。將接種有W-10的復篩平板培養基培養72 h后，用0.1%剛果紅水溶液浸染15 min，再用1 mol/L NaCl水溶液脫色，剛果紅可將未被降解的CMC染成紅色，而接種有W-10菌落處形成了透明的水解圈，初步表明W-10具有較好的纖維素分解能力。

2.2W-10的CMCase活性分析

將W-10菌株接種到以CMC-Na為唯一碳源的限制性液體培養基上，在50 ℃、不同pH值（pH值分別為4、5、6、7、8、9、10）條件下培養72 h，按照DNS法測定菌株的羧甲基纖維素酶活性。圖2結果表明，W-10菌株的羧甲基纖維素酶活性的pH值適應范圍較寬，在pH值為5時達到最高值14475 U/mL，并在pH值為 5～8范圍內均保持較高水平。

2.3纖維素分解酶活性分析

將菌株W-10接種于羧甲基纖維素鈉液態培養基上，50 ℃ 培養72 h，取其粗酶液測定菌株的CMCase、微晶纖維素酶、β-葡萄糖苷酶的酶活性。結果表明，在50 ℃時，菌株 W-10的CMCase、微晶纖維素酶、β-葡萄糖苷酶3種酶活性均較高，分別為（144.75±0.12）、（94.11±0.15）、（80.55±0.08） U/mL。

2.4蛋白質降解酶和α-淀粉降解酶活性分析

在堆肥基質中，除了纖維素外，還有其他的糖類及蛋白質存在，因此，研究該菌株對多種大分子有機物的降解能力具有重要意義。將所選定的W-10菌株于50 ℃培養72 h后，將其粗酶液進行纖維素酶、蛋白酶、α-淀粉酶活性的研究。

由圖3可知，50 ℃培養72 h后，W-10菌株纖維素酶、蛋白酶、α-淀粉酶的酶活性分別達到144.75、97.51、83.85 U/mL，其中以纖維素降解酶的活性最高。

2.5菌種鑒定及系統發育分析

2.5.1菌株的形態鑒定

2.5.1.1菌株的菌落與形態特征

將菌株W-10接種于牛肉膏蛋白胨培養基上培養后，該菌菌落呈圓形、白色、表面粗糙褶皺、邊緣不整齊。油鏡下觀察，菌體呈短桿狀、末端鈍圓、有芽孢、呈橢圓狀，位于菌體中央或稍偏，革蘭氏染色陽性。

2.5.1.3菌株的16S rDNA序列分析

如圖4所示，W-10菌株與枯草芽孢桿菌相似性最高，結合W-10菌株的菌落形態特征和生理生化特性，初步確定該菌株為枯草芽孢桿菌。

3結論與討論

高溫堆肥是利用不同微生物間的協同作用，將復雜的大分子有機物降解為細胞可以吸收利用的小分子物質，并釋放出CO2、能量和熱量的過程。在高溫堆肥過程中，高溫高效纖維素降解菌株對堆肥物料的分解起著至關重要的作用。本研究采用纖維素剛果紅平板透明圈篩選法，從高溫堆肥物料中分離、純化、篩選出1株高溫菌W-10，該菌株具有同時分解淀粉、蛋白質和纖維素等大分子有機物的能力。在pH值為5.0和溫度為50 ℃時，羧甲基纖維素酶、蛋白酶和α-淀粉酶的酶活性達到最高值，分別為144.75、97.51、83.85 U/mL，并且具有很好的熱穩定性。將測得的16S rDNA基因序列在NCBI數據庫中進行同源性比對，綜合形態特征和16S rDNA基因序列同源性分析，將該菌株初步鑒定為枯草芽孢桿菌。該菌株繁殖能力強、作用溫度范圍廣、熱穩定性好、作用底物廣泛，有利于工業化生產，又是自然界中廣泛存在的非致病細菌，對人畜無害，不污染環境，所以高效高溫菌W-10具有良好的研究和應用前景。

參考文獻：

[1]頓寶慶，吳薇，王旭靜，等. 一株高纖維素酶活力纖維素分解菌的分離與鑒定[J]. [HJ1.7mm]中國農業科技導報，2008，10（1）：113-117.

[2]白春艷，魏如騰，侯紅萍. 多菌混合發酵產纖維素酶及生物法預處理秸稈的研究[J]. 中國釀造，2016，35（1）：57-61.

[3]薛橋麗，王煒，胡永金，等. 堆肥中高溫纖維素酶菌株的篩選及其酶性質研究[J]. 中國釀造，2012，31（1）：30-33.

[4]李國學，張福鎖. 固體廢物堆肥化與有機復混肥生產[M]. 北京：化學工業出版社，2000.

[5]Tuomela M，Vikman M，Halakka A，et al. Biodegradation of lignin in a compost environment：a review[J]. Bioresource Technology，2000，72（2）：169-183.

[6]石文卿，陶能國，劉躍進，等. 一株高產纖維素酶真菌的分離及產酶特性研究[J]. 環境工程學報，2011，5（6）：1435-1440.

[7]司美茹，薛泉宏，蔡艷. 混合發酵對纖維素酶和淀粉酶活性的影響[J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版），2002，30（5）：69-73.

[8]武秀琴. 康寧木霉TZ-1產酶條件的研究[J]. 食品與發酵科技，2009，45（148）：44-46.

[9]吳國峰. 工業發酵分析[M]. 北京：化學工業出版社，2006.[ZK）]

[10]王朋朋，常娟，王平. 蛋白酶和淀粉酶產生菌的篩選及酶學性質分析研究[J]. 動物生產，2009，45（21）：48-51.

[11][JP2]別小妹，陸兆新，房耀維，等. 利用16S rDNA序列分析鑒定[JP2]一株產抗菌物質的微生物菌株[J]. 食品科學，[JP3]2006，27（11）：466-470.[JP]