鴨坦布蘇病毒的分離和PCR鑒定

曹宗喜+賀冬梅++葉保國(guó)+張艷++楊少雄++陳朝喜+林哲敏

摘要：鴨坦布蘇病是危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。從某鴨場(chǎng)的疑似鴨坦布蘇病病死鴨中分離到1株病毒，并對(duì)該毒株進(jìn)行PCR鑒定和序列分析。結(jié)果顯示，分離株的序列與GenBank上登錄的DTMUV序列的同源性在99%以上，表明分離的病毒為鴨坦布蘇病毒。

關(guān)鍵詞：鴨坦布蘇病毒；分離；PCR鑒定

中圖分類號(hào)： S858.325.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）05-0152-01

鴨坦布蘇病毒病（duck tembusu virus disease）是由鴨坦布蘇病毒（duck tembusu virus，DTMUV）感染所致的蛋鴨、種鴨以產(chǎn)蛋率和采食量突然下降為主要特征的傳染病[1-2]。該病自2010年在福建省、浙江省、江蘇省、安徽省、山東省、河北省等地區(qū)的鴨群中相繼暴發(fā)，約導(dǎo)致1.2億羽蛋鴨和1 500萬(wàn)羽肉鴨發(fā)病，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元，對(duì)我國(guó)鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失[3-5]。雞、鴨以及養(yǎng)殖場(chǎng)周圍的麻雀、蚊子均有被感染的報(bào)道[6-8]，這為該病的防控提出了新挑戰(zhàn)。本研究以鴨坦布蘇病疑似樣品為研究對(duì)象進(jìn)行病原分離鑒定，為鴨坦布蘇病毒的進(jìn)化關(guān)系及其致病性的進(jìn)一步研究提供了參考。

1材料

RNAiso Plus、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）、DL 2 000 DNA marker均購(gòu)自TaKaRa公司。

2方法

2.1病料采集與處理

從國(guó)內(nèi)主要鴨養(yǎng)殖區(qū)收集鴨坦布蘇病疑似樣品。無(wú)菌采集病鴨的肝臟、脾臟等病變組織，取病料約1.0 g并置于滅菌研磨器中，加入5倍體積含抗生素的PBS緩沖液研磨制成混懸液，反復(fù)凍融3次，以8 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜除菌，置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2病毒分離

[JP2]將處理好的病料接種于9～11 d的鴨胚，每個(gè)胚接種 0.2 mL，每天觀察鴨胚。如果無(wú)死亡鴨胚則7 d收獲，盲傳5代仍無(wú)病變且用PCR方法檢測(cè)為陰性者，作為病毒分離陰性。[JP]

2.3引物設(shè)計(jì)與合成

參照胡旭東等的引物[9]進(jìn)行設(shè)計(jì)，F(xiàn)：5′-GCCACGGAATTAGCGGTTGT-3′；R：5′-TAATCCTCCATCTCAGCGGTGTAG-3′。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，采用滅菌超純水稀釋至10 μmol/L，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4PCR鑒定

RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。擴(kuò)增體系及程序分別以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（20 μL）為：10×Ex Taq buffer 2 μL、上游及下游引物各1 μL、dNTP Mixture 2 μL、Ex Taq酶0.1 μL、cDNA 2 μL，加水補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取PCR產(chǎn)物5 μL，采用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察并分析PCR產(chǎn)物。按凝膠回收試劑盒說明書純化回收PCR產(chǎn)物，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序，采用Lasergene 7.10軟件對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

3結(jié)果與分析

3.1病毒分離

病毒分離時(shí)，試驗(yàn)組鴨胚于3～7 d內(nèi)部分死亡，可見胚體出血水腫、發(fā)育不良。

3.2PCR擴(kuò)增

取PCR產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，分離株出現(xiàn)400 bp的條帶，與預(yù)期目的條帶相符。

3.3基因序列測(cè)定與分析

采用Lasergene 7.10軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，所[CM（25]擴(kuò)增序列與GenBank上登錄的DTMUV序列的同源性在

99%以上，表明分離的病毒為鴨坦布蘇病毒。

4討論

鴨坦布蘇病是危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一[3，5]。對(duì)某鴨場(chǎng)發(fā)病鴨根據(jù)流行病學(xué)、臨床特征、剖檢特點(diǎn)初步診斷為鴨坦布蘇病，經(jīng)過病毒分離，獲得病毒分離株。通過PCR擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的400 bp目的片段，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序及Blast分析，確定分離病原為鴨坦布蘇病毒。本試驗(yàn)為鴨坦布蘇病毒進(jìn)化關(guān)系及其致病性的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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