鴨坦布蘇病毒的分離和PCR鑒定

曹宗喜+賀冬梅++葉保國+張艷++楊少雄++陳朝喜+林哲敏

摘要：鴨坦布蘇病是危害養鴨業最嚴重的傳染病之一。從某鴨場的疑似鴨坦布蘇病病死鴨中分離到1株病毒，并對該毒株進行PCR鑒定和序列分析。結果顯示，分離株的序列與GenBank上登錄的DTMUV序列的同源性在99%以上，表明分離的病毒為鴨坦布蘇病毒。

關鍵詞：鴨坦布蘇病毒；分離；PCR鑒定

中圖分類號： S858.325.3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0152-01

鴨坦布蘇病毒病（duck tembusu virus disease）是由鴨坦布蘇病毒（duck tembusu virus，DTMUV）感染所致的蛋鴨、種鴨以產蛋率和采食量突然下降為主要特征的傳染病[1-2]。該病自2010年在福建省、浙江省、江蘇省、安徽省、山東省、河北省等地區的鴨群中相繼暴發，約導致1.2億羽蛋鴨和1 500萬羽肉鴨發病，經濟損失達數十億元，對我國鴨養殖業造成了巨大損失[3-5]。雞、鴨以及養殖場周圍的麻雀、蚊子均有被感染的報道[6-8]，這為該病的防控提出了新挑戰。本研究以鴨坦布蘇病疑似樣品為研究對象進行病原分離鑒定，為鴨坦布蘇病毒的進化關系及其致病性的進一步研究提供了參考。

1材料

RNAiso Plus、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）、DL 2 000 DNA marker均購自TaKaRa公司。

2方法

2.1病料采集與處理

從國內主要鴨養殖區收集鴨坦布蘇病疑似樣品。無菌采集病鴨的肝臟、脾臟等病變組織，取病料約1.0 g并置于滅菌研磨器中，加入5倍體積含抗生素的PBS緩沖液研磨制成混懸液，反復凍融3次，以8 000 r/min離心10 min，取上清液經0.22 μm濾膜除菌，置于-20 ℃下保存備用。

2.2病毒分離

[JP2]將處理好的病料接種于9～11 d的鴨胚，每個胚接種 0.2 mL，每天觀察鴨胚。如果無死亡鴨胚則7 d收獲，盲傳5代仍無病變且用PCR方法檢測為陰性者，作為病毒分離陰性。[JP]

2.3引物設計與合成

參照胡旭東等的引物[9]進行設計，F：5′-GCCACGGAATTAGCGGTTGT-3′；R：5′-TAATCCTCCATCTCAGCGGTGTAG-3′。引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成，采用滅菌超純水稀釋至10 μmol/L，于-20 ℃下保存備用。

2.4PCR鑒定

RNA抽提和反轉錄按照試劑盒說明書進行操作。擴增體系及程序分別以反轉錄的cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系（20 μL）為：10×Ex Taq buffer 2 μL、上游及下游引物各1 μL、dNTP Mixture 2 μL、Ex Taq酶0.1 μL、cDNA 2 μL，加水補足至20 μL。擴增反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃延伸7 min。取PCR產物5 μL，采用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察并分析PCR產物。按凝膠回收試劑盒說明書純化回收PCR產物，由英濰捷基（上海）貿易有限公司進行測序，采用Lasergene 7.10軟件對所測序列進行Blast比對分析。

3結果與分析

3.1病毒分離

病毒分離時，試驗組鴨胚于3～7 d內部分死亡，可見胚體出血水腫、發育不良。

3.2PCR擴增

取PCR產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳，分離株出現400 bp的條帶，與預期目的條帶相符。

3.3基因序列測定與分析

采用Lasergene 7.10軟件對測序結果進行同源性分析，所[CM（25]擴增序列與GenBank上登錄的DTMUV序列的同源性在

99%以上，表明分離的病毒為鴨坦布蘇病毒。

4討論

鴨坦布蘇病是危害養鴨業最嚴重的傳染病之一[3，5]。對某鴨場發病鴨根據流行病學、臨床特征、剖檢特點初步診斷為鴨坦布蘇病，經過病毒分離，獲得病毒分離株。通過PCR擴增出與預期大小相符的400 bp目的片段，對擴增片段進行測序及Blast分析，確定分離病原為鴨坦布蘇病毒。本試驗為鴨坦布蘇病毒進化關系及其致病性的進一步研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1]Su J，Li S，Hu X，et al. Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus，a new Tembusu-related flavivirus[J]. PLoS One，2011，6（3）：e18106.

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[3]Cao Z Z，Zhang C，Liu Y E，et al. Tembusu virus in ducks，China[J]. Emerging Infectious Diseases，2011，17（10）：1873-1875.

[4]Li L L，An H J，Sun M H，et al. Identification and genomic analysis of two duck-origin Tembusu virus strains in Southern China[J]. Virus Genes，2012，45（1）：105-112.

[5]Zhu W J，Chen J D，Wei C Y，et al. Complete genome sequence of duck tembusu virus，isolated from muscovy ducks in Southern China[J]. Journal of Virology，2012，86（23）：13119.

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[7]Tang Y，Diao Y，Chen H，et al. Isolation and genetic characterization of a tembusu virus strain isolated from mosquitoes in Shandong，China[JP2][J]. Transboundary and Emerging Diseases，2015，62（2）：209-216.[JP]

[8]Tang Y，Diao Y，Yu C，et al. Characterization of a tembusu virus isolated from naturally infected house sparrows （passer domesticus） in Northern China[J]. Transboundary and Emerging Diseases，2013，60（2）：152-158.

[9]胡旭東，路浩，劉培培，等. 我國發現的一種引起鴨產蛋下降綜合征的新型黃病毒[J]. 中國獸醫雜志，2011，47（7）：43-47.