新疆邊境庫(kù)車縣圖蘭扇頭蜱形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

武軍元++程尚鵬+閆峰峰+王遠(yuǎn)志

摘要：應(yīng)用數(shù)碼體視顯微鏡觀察采自新疆庫(kù)車縣羊體寄生蜱蟲的形態(tài)學(xué)特征，應(yīng)用分子生物學(xué)分析方法對(duì)采集的蜱蟲進(jìn)行線粒體16S rDNA基因序列擴(kuò)增、測(cè)序，運(yùn)用MEGA 6.0軟件鄰接法（neighbour-joining，簡(jiǎn)稱NJ）構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，確定蜱蟲的進(jìn)化生物學(xué)特征。結(jié)果表明，新疆庫(kù)車縣的蜱種主要為圖蘭扇頭蜱，分子水平上具有較高的生物多樣性。

關(guān)鍵詞：新疆；蜱；形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)；16S rDNA基因；遺傳進(jìn)化

中圖分類號(hào)： S852.74+6文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）05-0149-03

蜱類是寄生于兩棲類、鳥類、爬行類和哺乳類等動(dòng)物體表的專性吸血寄生蟲，全世界共有896種，我國(guó)明確定名的有117種，其中最常見、危害最嚴(yán)重的是硬蜱[1-4]。我國(guó)現(xiàn)有大部分蜱類具有傳播病原體的潛能，部分蜱可以傳播2種以上病原體[5]，對(duì)人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來極大的危害。新疆地處亞歐大陸腹地，中國(guó)西北邊陲，復(fù)雜多樣的生態(tài)地理環(huán)境為多種蜱蟲提供了繁衍生息所需的適宜條件，因此，加強(qiáng)對(duì)新疆蜱種及蜱傳疫病的監(jiān)測(cè)有利于我國(guó)對(duì)蜱傳病的控制，以及對(duì)蜱傳病原外來入侵的聯(lián)防聯(lián)控具有重要意義。庫(kù)車縣位于新疆南疆邊境地區(qū)，目前，對(duì)庫(kù)車縣牲畜寄生蜱種的報(bào)道較少，本研究應(yīng)用分子生物學(xué)方法結(jié)合形態(tài)學(xué)手段對(duì)新疆庫(kù)車縣的蜱蟲進(jìn)行分析鑒定。

1材料與方法

1.1.2主要試劑與儀器

PCR所用試劑均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA kit、DNA marker、DNA回收試劑盒、T4 DNA連接酶試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；其他所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。梯度PCR儀、全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)、高速離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；LEICAM165 C數(shù)碼體視顯微鏡，購(gòu)自同舟同德（北京）儀器儀表有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)

參照杜景云所報(bào)道的蜱蟲線粒體16S rDNA 基因序列[6]設(shè)計(jì)以下引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成

《中國(guó)經(jīng)濟(jì)昆蟲志》和《新疆蜱類志》[8]，用配備數(shù)碼照相功能的解剖顯微鏡拍攝圖片，對(duì)蜱蟲的盾板、假頭、假頭基、肛側(cè)板（雄蜱）、氣門板、第一緣垛、孔區(qū)（雌蜱）形態(tài)進(jìn)行對(duì)比觀察并測(cè)量長(zhǎng)度。[JP]

1.2.3蟲體處理和DNA提取

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后的蟲體分別用濃度為70%、50%、30%、10%的乙醇溶液于37 ℃搖床沖洗1 h，再用超純水反復(fù)沖洗、干燥，放置于消毒滅菌的 1.5 mL EP管中。按照DNA提取試劑盒提取蜱蟲DNA，放置于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.416S rDNA基因克隆

用設(shè)計(jì)的16S rDNA基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用25 μL的反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U）0.25 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），cDNA模板 2 μL，補(bǔ)足水至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，5 min；94 ℃預(yù)變性5 min，92 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共38個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物在 1.2% 瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.5序列分析及遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建

應(yīng)用序列分析軟件DNAStar將所得序列與GenBank中公布的蜱蟲序列進(jìn)行同源性比較，用MEGA 6.0軟件的Neighbour-Joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹，分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

本次采集的蜱蟲體型較小，雌蟲體長(zhǎng)3.2～5.5 mm，雄蟲體長(zhǎng)約2.9～3.6 mm，均呈褐色，背腹扁平似卵圓形，芝麻至米粒大，雌蟲吸飽血后可膨脹達(dá)蓖麻籽大，身體主要分為假頭部和軀體部2個(gè)部分（圖1）；假頭基呈六角形，側(cè)角明顯，后緣微凹（圖2-A），蟲體完全被盾板覆蓋（雄蜱）（圖1-C），或前部盾板覆蓋（雌蜱）（圖1-A），前部較窄，后部圓鈍，盾板有花斑、復(fù)眼，復(fù)眼在靠近盾板的邊緣，有緣垛（圖2-D），須肢粗短，中部最寬，前端稍窄，氣門板逗點(diǎn)狀（圖2-B），中垛大于邊垛，常有尾突（圖2-C、D），有肛溝，雄性肛側(cè)板后緣內(nèi)斜明顯，內(nèi)緣具角突，長(zhǎng)約為寬的2.5～3.0倍，內(nèi)緣中部稍凹，后緣向內(nèi)顯著傾斜，其后方凸角明顯（2-B）。上述特征符合熱孜萬等報(bào)道的硬蜱科扇頭蜱屬圖蘭扇頭蜱的特征[9]。

PCR擴(kuò)增蜱蟲線粒體16S rDNA基因，產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，得到460 bp左右核酸片段，與預(yù)期片段大小相符。

2.3序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

通過測(cè)序50頭蜱蟲的16S rDNA基因片段得到3種不同的序列，登錄http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi比對(duì)分析，表明蜱蟲為圖蘭扇頭蜱（Rhipicephalus turanicus）。應(yīng)用MEGA 6.0軟件的Neighbour-Joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹（圖4）。

基于16S rDNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，此次采集的蜱蟲主要為圖蘭扇頭蜱，可分為3種類型，第1種類型與以色列的圖蘭扇頭蜱分子進(jìn)化水平相似，第2種類型與張璘報(bào)道的圖蘭扇頭蜱相似[10]，第3種與美國(guó)的圖蘭扇頭蜱相似，說明本次采集的圖蘭扇頭蜱呈現(xiàn)分子水平上的生物多樣性。

3討論

近年來，隨著分子流行病學(xué)研究手段的不斷深入，我國(guó)從蜱種內(nèi)分離到部分新發(fā)蜱傳病原體[11]，對(duì)當(dāng)?shù)厝诵蠼】翟斐闪艘欢ǖ奈：ΑＰ陆貐^(qū)陸續(xù)分離到的蜱傳病原主要有腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、新疆出血熱病毒、新環(huán)狀病毒、辛德畢斯病毒、西方馬腦炎病毒、乙腦病毒、西尼羅病毒、遼寧病毒、Tahyna病毒等，其中，部分病毒系新疆首次發(fā)現(xiàn)[12]。[JP+1]研究報(bào)道，蜱傳疫病與蜱種孳生環(huán)境以及蜱蟲種類有著密切的關(guān)系，親緣關(guān)系越近的蜱種傳播同種病原的概率越大[13]。因此，開展蜱種分布的調(diào)查對(duì)地方性蜱類與蜱傳疾病的防治工作具有重要的意義。本研究形態(tài)學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，庫(kù)車縣羊體寄生的蜱種主要為圖蘭扇頭蜱。該縣位于新疆南疆阿克蘇地區(qū)東部邊緣的塔里木盆地，常年干旱少雨，適合圖蘭扇頭蜱的生存繁衍，此次調(diào)查蜱種主要為圖蘭扇頭蜱，可能與這一特殊的地理環(huán)境有關(guān)。近年來，隨著全球氣候的不斷變化，蜱種不斷增多，以及宿主與生境關(guān)系的改變，傳統(tǒng)依靠形態(tài)學(xué)鑒定的方法已不能有效地對(duì)蜱種進(jìn)行分類，線粒體DNA序列作為進(jìn)化生物學(xué)重要的遺傳標(biāo)記，不僅能體現(xiàn)物種分子的進(jìn)化規(guī)律，更能用于種內(nèi)遺傳的差異分析，16S rDNA基因序列由于具有高度保守性，目前已被應(yīng)用于蜱種分類學(xué)研究[14]。本研究在對(duì)采集蜱種形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)之上，通過分析線粒體16S rDNA的基因序列，進(jìn)一步明確新疆南疆庫(kù)車縣羊體寄生的蜱種主要為圖蘭扇頭蜱。本研究結(jié)果為系統(tǒng)研究當(dāng)?shù)仳绶N生態(tài)分布，以及預(yù)防和控制當(dāng)?shù)叵x媒病的傳播具有重要意義。

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