新疆邊境庫車縣圖蘭扇頭蜱形態學及分子生物學鑒定

武軍元++程尚鵬+閆峰峰+王遠志

摘要：應用數碼體視顯微鏡觀察采自新疆庫車縣羊體寄生蜱蟲的形態學特征，應用分子生物學分析方法對采集的蜱蟲進行線粒體16S rDNA基因序列擴增、測序，運用MEGA 6.0軟件鄰接法（neighbour-joining，簡稱NJ）構建遺傳進化樹，確定蜱蟲的進化生物學特征。結果表明，新疆庫車縣的蜱種主要為圖蘭扇頭蜱，分子水平上具有較高的生物多樣性。

關鍵詞：新疆；蜱；形態學結構；16S rDNA基因；遺傳進化

中圖分類號： S852.74+6文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）05-0149-03

蜱類是寄生于兩棲類、鳥類、爬行類和哺乳類等動物體表的專性吸血寄生蟲，全世界共有896種，我國明確定名的有117種，其中最常見、危害最嚴重的是硬蜱[1-4]。我國現有大部分蜱類具有傳播病原體的潛能，部分蜱可以傳播2種以上病原體[5]，對人類健康和畜牧業生產帶來極大的危害。新疆地處亞歐大陸腹地，中國西北邊陲，復雜多樣的生態地理環境為多種蜱蟲提供了繁衍生息所需的適宜條件，因此，加強對新疆蜱種及蜱傳疫病的監測有利于我國對蜱傳病的控制，以及對蜱傳病原外來入侵的聯防聯控具有重要意義。庫車縣位于新疆南疆邊境地區，目前，對庫車縣牲畜寄生蜱種的報道較少，本研究應用分子生物學方法結合形態學手段對新疆庫車縣的蜱蟲進行分析鑒定。

1材料與方法

1.1.2主要試劑與儀器

PCR所用試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA kit、DNA marker、DNA回收試劑盒、T4 DNA連接酶試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；其他所用試劑均為國產分析純。梯度PCR儀、全自動凝膠成像分析系統、高速離心機為德國Eppendorf公司產品；LEICAM165 C數碼體視顯微鏡，購自同舟同德（北京）儀器儀表有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設計

參照杜景云所報道的蜱蟲線粒體16S rDNA 基因序列[6]設計以下引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成

《中國經濟昆蟲志》和《新疆蜱類志》[8]，用配備數碼照相功能的解剖顯微鏡拍攝圖片，對蜱蟲的盾板、假頭、假頭基、肛側板（雄蜱）、氣門板、第一緣垛、孔區（雌蜱）形態進行對比觀察并測量長度。[JP]

1.2.3蟲體處理和DNA提取

經形態學鑒定后的蟲體分別用濃度為70%、50%、30%、10%的乙醇溶液于37 ℃搖床沖洗1 h，再用超純水反復沖洗、干燥，放置于消毒滅菌的 1.5 mL EP管中。按照DNA提取試劑盒提取蜱蟲DNA，放置于-20℃條件下保存備用。

1.2.416S rDNA基因克隆

用設計的16S rDNA基因引物進行PCR擴增，采用25 μL的反應體系：10×PCR緩沖液 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U）0.25 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），cDNA模板 2 μL，補足水至25 μL。反應條件：95 ℃，5 min；94 ℃預變性5 min，92 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共38個循環；72 ℃終延伸8 min。PCR反應結束后，取5 μL反應產物在 1.2% 瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察結果。

1.2.5序列分析及遺傳進化樹構建

應用序列分析軟件DNAStar將所得序列與GenBank中公布的蜱蟲序列進行同源性比較，用MEGA 6.0軟件的Neighbour-Joining方法構建進化樹，分析其遺傳進化關系。

2結果與分析

2.1形態學鑒定結果

本次采集的蜱蟲體型較小，雌蟲體長3.2～5.5 mm，雄蟲體長約2.9～3.6 mm，均呈褐色，背腹扁平似卵圓形，芝麻至米粒大，雌蟲吸飽血后可膨脹達蓖麻籽大，身體主要分為假頭部和軀體部2個部分（圖1）；假頭基呈六角形，側角明顯，后緣微凹（圖2-A），蟲體完全被盾板覆蓋（雄蜱）（圖1-C），或前部盾板覆蓋（雌蜱）（圖1-A），前部較窄，后部圓鈍，盾板有花斑、復眼，復眼在靠近盾板的邊緣，有緣垛（圖2-D），須肢粗短，中部最寬，前端稍窄，氣門板逗點狀（圖2-B），中垛大于邊垛，常有尾突（圖2-C、D），有肛溝，雄性肛側板后緣內斜明顯，內緣具角突，長約為寬的2.5～3.0倍，內緣中部稍凹，后緣向內顯著傾斜，其后方凸角明顯（2-B）。上述特征符合熱孜萬等報道的硬蜱科扇頭蜱屬圖蘭扇頭蜱的特征[9]。

PCR擴增蜱蟲線粒體16S rDNA基因，產物經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，得到460 bp左右核酸片段，與預期片段大小相符。

2.3序列比對與系統進化樹構建

通過測序50頭蜱蟲的16S rDNA基因片段得到3種不同的序列，登錄http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi比對分析，表明蜱蟲為圖蘭扇頭蜱（Rhipicephalus turanicus）。應用MEGA 6.0軟件的Neighbour-Joining方法構建進化樹（圖4）。

基于16S rDNA的系統進化樹顯示，此次采集的蜱蟲主要為圖蘭扇頭蜱，可分為3種類型，第1種類型與以色列的圖蘭扇頭蜱分子進化水平相似，第2種類型與張璘報道的圖蘭扇頭蜱相似[10]，第3種與美國的圖蘭扇頭蜱相似，說明本次采集的圖蘭扇頭蜱呈現分子水平上的生物多樣性。

3討論

近年來，隨著分子流行病學研究手段的不斷深入，我國從蜱種內分離到部分新發蜱傳病原體[11]，對當地人畜健康造成了一定的危害。新疆地區陸續分離到的蜱傳病原主要有腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、新疆出血熱病毒、新環狀病毒、辛德畢斯病毒、西方馬腦炎病毒、乙腦病毒、西尼羅病毒、遼寧病毒、Tahyna病毒等，其中，部分病毒系新疆首次發現[12]。[JP+1]研究報道，蜱傳疫病與蜱種孳生環境以及蜱蟲種類有著密切的關系，親緣關系越近的蜱種傳播同種病原的概率越大[13]。因此，開展蜱種分布的調查對地方性蜱類與蜱傳疾病的防治工作具有重要的意義。本研究形態學調查結果表明，庫車縣羊體寄生的蜱種主要為圖蘭扇頭蜱。該縣位于新疆南疆阿克蘇地區東部邊緣的塔里木盆地，常年干旱少雨，適合圖蘭扇頭蜱的生存繁衍，此次調查蜱種主要為圖蘭扇頭蜱，可能與這一特殊的地理環境有關。近年來，隨著全球氣候的不斷變化，蜱種不斷增多，以及宿主與生境關系的改變，傳統依靠形態學鑒定的方法已不能有效地對蜱種進行分類，線粒體DNA序列作為進化生物學重要的遺傳標記，不僅能體現物種分子的進化規律，更能用于種內遺傳的差異分析，16S rDNA基因序列由于具有高度保守性，目前已被應用于蜱種分類學研究[14]。本研究在對采集蜱種形態學觀察的基礎之上，通過分析線粒體16S rDNA的基因序列，進一步明確新疆南疆庫車縣羊體寄生的蜱種主要為圖蘭扇頭蜱。本研究結果為系統研究當地蜱種生態分布，以及預防和控制當地蟲媒病的傳播具有重要意義。

參考文獻：

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