紫外線脅迫麥長管蚜DNA差異片段的克隆及序列功能分析

趙永田+趙惠燕

摘要：應用擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP）技術對紫外線誘導的麥長管蚜基因組變異進行篩選，對獲得的63個差異片段進行回收克隆測序。經Blast分析，發現19條同源性高的基因，按照基因功能可將差異序列劃分為5類：防御基因、調節能量和信號基因、蛋白質合成基因、損害基因、未知功能基因。蚜蟲對紫外線的響應機制涉及多種代謝過程的基因，如與能量代謝和信號傳導、細胞凋亡等有關的基因，還涉及具有保守結構域的調控因子等。

關鍵詞：紫外線；麥長管蚜；DNA片段；克隆；序列分析

中圖分類號： S435.122+.2文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）05-0102-03

蚜蟲是小麥上的主要害蟲，其中麥長管蚜[Sitobion avenae （Fabricius）]作為麥蚜的優勢種群，可通過傳播病毒、刺吸汁液、分泌蜜露等方式為害，嚴重影響小麥的產量和品質。蚜蟲作為r對策者，環境是導致種群分化的主要因素[1-2]。近年來，臭氧層空洞導致紫外線輻射劑量增加，特別是UV-B波段[3]，不可避免地對蚜蟲的遺傳與進化產生巨大的選擇壓力。姚建秀等運用隨機擴增多態性DNA標記（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）技術對麥長管蚜輻射誘導一代的DNA多態性進行分析表明，輻射條件下的遺傳距離增大，紫外線可誘導產生種下分化[4]。都二霞等通過設置不同時間和強度的紫外線照射桃蚜，運用SSR（simple sequence repeats）技術研究發現，F1代桃蚜產生可遺傳變異致使F2代的DNA也發生變異，且各處理平均多態位點率之間差異顯著[5]。趙惠燕等對桃蚜設置不同時間的紫外線誘導，采用SSH（spring struts hibernate）技術提取了產生的特異基因，進行克隆、測序，分析了差異基因的功能，得出6類相關基因參與紫外線脅迫[6]。AFLP結合了限制性內切酶片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP）的可靠性與PCR的便捷，具有重復性好、結果可靠等特點。AFLP是較為理想的檢測基因組差異的手段，原因在于它不需要提前知曉基因組序列，可直接用于檢測。張根發等對低能離子誘導擬南芥引起的基因組DNA變異采用AFLP進行檢測，并對差異片段進行克隆，測序發現突變可能存在突變熱點[7]。陳照立等應用AFLP成功回收了與二羥環氧苯并芘（BPDE）相互作用產生的DNA差異片段，經克隆測序及同源性比對發現，9條可能導致BPDE引發肺癌有關的基因片段[8]。然而利用AFLP對紫外線誘導麥長管蚜的遺傳變異分析尚未見報道。本研究選擇麥長管蚜為試驗材料，利用AFLP技術分析經紫外線處理和對照組之間的DNA變異，對差異基因進行篩選、克隆、測序，分析差異基因的功能，初步探索蚜蟲對紫外線的響應機制，為蚜蟲進化研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1試蟲

試驗蟲源由德國聯邦農林生物研究中心提供。處理方法：取發育一致的成蟲，分成對照組和試驗組。試驗組經紫外線照射時間為1、2、3、4、6、8 h；對照組采用正常光照。光源高度統一為蚜蟲上方30 cm處。處理后的當代成蚜標記為F0代，繼續培養2代，均按照同樣處理照射成蟲，并依繁殖次序收集成蟲標記為F1、F2代。

1.2方法

1.2.1DNA池的構建及AFLP反應體系

分別對不同處理時間的蚜蟲構建DNA池。DNA的提取方法及AFLP反應體系參考文獻[9]。

1.2.2差異表達片斷的回收、克隆與測序

用刀片切取差異條帶，用ddH2O浸泡后，取上清液重新擴增，從瓊脂糖凝膠上回收二次擴增差異片段。將回收產物連接于pMD18-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，復蘇后37 ℃培養過夜，挑取陽性（白斑）克隆進行菌落PCR。經鑒定的陽性克隆送上海生工生物工程公司測序。

1.2.3同源性比對

測序結果輸入美國國家生物技術信息中心NCBI（http：//www.ncbi..nlm.nih.gov）網站，并應用Blast工具對差異片段序列同源性進行比對。

2結果與分析

2.1差異片斷的AFLP分析

擴增的差異性主要體現為條帶的增加或缺失。通過統計差異條帶數目，計算不同處理的變異頻率發現，變異頻率隨著處理時間的增加而增大，且二者之間存在著正相關，此結論與文獻[10]研究結果一致。

2.2差異片段的克隆與菌落PCR鑒定

可知，質粒的擴增片段大小與回收的差異片段一致，表明差異片段成功連接在質粒載體上。

2.3同源性功能分析

對63個克隆成功的序列經測序并通過Blast比對分析，發現有19個同源性高的基因序列，在比對的過程中發現，有4個序列經同源性檢測都為Fgd6 protein鳥嘌呤核苷酸交換因子，2個序列為HSP15熱休克蛋白。主要可能參與脅迫響應的基因功能如表1所示，未列出未知功能基因。進一步分析相關基因的功能，可以將19個序列分成5大類：防御基因，約占21%；調節能量與信號基因，約占37%；蛋白質合成基因，約占5%；損害基因，約占11%；未知功能基因，約占26%（圖3）。

3結論與討論

通過AFLP技術，共有63個差異片段克隆并測序成功，結果表明，經紫外線誘導的蚜蟲DNA變異可以采用AFLP技術進行差異檢測與篩選。本研究與趙惠燕等的研究結論[6]一致，經紫外線脅迫后調節能量與信號基因和防御基因表達明顯增多，表明蚜蟲面對脅迫能積極作出應激反應。如Hsp15，作為小分子應激蛋白熱休克蛋白，可以與質膜結合[11]，而質膜是細胞吸收外界物質的動態屏障，也是信息傳遞的通道，起到保護作用。同時小分子熱激蛋白因為具有分子伴侶的作用，所以在不良條件下可以降低蛋白的合成折疊出現異常的概率和穩定性，在不良條件下提高生存率[12]。部分熱激蛋白在序列上與細胞防脫水蛋白存在某種相似性，這種相似性可以抑制細胞脫水，使溶質不易發生滲透，從而減輕冷脅迫對細胞膜的損害，使組織的抗冷性增強[13]。質膜蛋白家族成員眾多，底物多樣，功能也較多，包括對抗生素產生抗性、轉換信號、表達抗原等[14-15]，但它們有共同的特點，能結合并水解ATP，通過細胞膜轉運各種物質[16]。核糖體蛋白L11在蛋白質合成過程中必不可少，并且是高度保守的蛋白質[17]。L11的N-末端具有分子開關功能，在EF-G依賴的遷移過程和RF1識別終止密碼子UAG的過程中都是必須的。Harms等研究表明，L11在核糖體的翻譯過程中起到分子開關的作用[18]。在脅迫的過程中發現，有損害功能的基因參與其中，如硫酸糖基化蛋白（94sin1），對細胞的存活及增殖分化有負性調節作用[19]，但具體作用機制還不清楚。除了已知的功能基因外，本研究還得到許多同源性較高，但功能未知的基因，有待進一步研究其在紫外線耐受方面的功能。

研究表明，蚜蟲對紫外線的脅迫響應機制非常復雜，涉及多途徑多種基因協同作用。雖然本研究獲得的差異基因反映的信息不夠全面，但通過篩選鑒別這些特異基因，分析其功能，是闡明蚜蟲對紫外線脅迫分子變異和響應機制的必要前提，同時為蚜蟲的分子進化提供理論依據。

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