黃萎病菌激活蛋白的提取及對棉花發芽的影響

張海萍+馬前程+麻浩+哈那提別克+顧愛星

摘要：為探索棉花黃萎病的生物防治方法，對棉花黃萎病病菌激活蛋白的提取方法及活性進行了研究。將從感染黃萎病的棉花組織中分離培養的棉花黃萎病病菌置于不同溫度、不同轉速條件下進行培養，對棉花黃萎病病菌的激活蛋白進行提取，用1 000倍、1 500倍、2 000倍激活蛋白稀釋液分別處理2個棉花品種（新陸中11號、新陸中50號）的種子，檢測激活蛋白對棉花種子發芽率的影響。結果表明，獲得該菌最佳發酵條件為26 ℃、200 r/min、72 h，在此條件下，菌絲干質量達5.88 g/L。經SDS-PAGE電泳檢測發現，在分子量為25 ku附近有1條集中的電泳譜帶；激活蛋白稀釋液能夠提高這2種棉花種子的發芽率，其中稀釋1 500倍時效果最明顯。結果表明，棉花黃萎病病菌激活蛋白具有高效的誘導激活活性，可為研制低成本的蛋白生物農藥提供理論依據。

關鍵詞：棉花；黃萎病菌；激活蛋白；發芽率

中圖分類號： S435.621.2+4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0096-03

棉花黃萎病是一種世界性病害，其危害大、持續時間長、可導致巨大經濟損失。棉花黃萎病的發生是因為土壤含大量菌，病原菌產生分化，缺乏抗棉花黃萎病的優良品種，溫濕度適宜條件不好，缺乏對棉花黃萎病嚴格的檢疫制度和有效快速的檢疫手段等。1935年棉花黃萎病從美國傳入我國，在陜西涇陽、山西運城、山東高密和河南安陽等地區相繼發生[1]。1970年以后，我國12個省（市、區）均發生了棉花黃萎病，主要集中在黃河流域棉區。據統計，2000年棉花黃萎病發病面積已經達到300萬hm2 [2]，種子交流使病原菌的種類越來越多，形成了復合種群（基因型）[3]。有研究表明，棉花黃萎病病菌的致病力均存在分化和變異，造成棉花黃萎病逐年加重的主要原因之一是強致病力菌系的出現[4]。農藥對農業生產做出了巨大貢獻，但是副作用很多，如環境污染、生態破壞、病蟲抗藥性和農產品安全性等問題，為解決這些問題出現了生物農藥、生物肥料，使用生物農藥、生物肥料是確保現代農產品安全生產、保護環境的關鍵技術措施，用生物肥料代替農藥已經成為一種趨勢。美國康奈爾大學韋忠民博士提出了過敏蛋白具有抗病性功能[5]。2001年美國Cornell 大學和EDEN 生物科技公司從過敏反應蛋白中共同開發和研制了具有抗病防蟲功能的蛋白質分子生物新農藥Messenger [6]。這[JP2]種產品在多種大田作物、經濟作物上效果十分明顯，對多種病蟲防治效果達50%～80%，增產10%～20%，是一種較為理想的環境友好型生物農藥。目前，具有代表性的微生物蛋白農藥有過敏蛋白（harpin）、隱地蛋白（crypogein）[7]和激活蛋白（activator）[8]等幾種類型。激活蛋白的作用機理在性質上類似動物免疫的一種抗病機制，無毒，在植物體內和土壤中易分解、無殘留，是一種適合農業需求和環境友好的生物農藥[9]。[JP]

黃萎病菌激活蛋白主要通過激活植物體內分子免疫系統，提高植物自身免疫力；通過激發植物體內的一系列代謝調控，促進植物根、莖、葉生長和提高葉綠素含量，從而提高作物產量。

本試驗為探索棉花黃萎病的生物防治方法，對棉花黃萎病病菌激活蛋白的提取及活性進行了初步研究。從感染黃萎病的棉花組織中分離培養棉花黃萎病病菌，置于不同溫度下以不同轉速進行培養，對棉花黃萎病病菌的激活蛋白進行提取，用激活蛋白處理棉花種子，檢測激活蛋白對棉花種子發芽的影響，探明棉花黃萎病病菌激活蛋白是否具有誘導激活活性，為研制低成本的蛋白生物農藥提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

1.1.1菌種棉花黃萎病病菌，采自石河子棉田的帶病棉花植株上，病原菌在新疆農業大學實驗樓生物技術實驗室進行分離培養，經鑒定為棉花黃萎病病菌。

1.1.2棉花種子棉花品種為新陸中11號、新陸中50號，均由新疆農業大學農學院作物遺傳育種實驗室提供。

1.1.3儀器立式壓力蒸汽滅菌器，購自上海博訊實業有限公司；1-15K高速冷凍離心機，購自德國SIGMA公司；HH.SY11-N單列兩孔水浴鍋，購自金壇市醫療儀器廠；FM100雪花制冰機，購自美國GRANT公司；FM2004電子天平，購自上海精密科學儀器有限公司。

1.1.4試劑Tris-HCl、丙烯酰胺、甘氨酸、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺、考馬斯亮蘭R-250、二硫蘇糖醇、十二烷基硫酸鈉（SDS）、溴酚藍、甘油、甲醇、乙酸等，均為國產分析純。

1.2試驗方法

1.2.1棉花黃萎病病菌發酵條件的優化[10]

將棉花黃萎病病菌接種在PDA固體培養基上培養，打3個菌餅置于裝有100 mL PDA液體培養基的三角瓶（ 250 mL）中，設9個重復，進行振蕩培養，記錄菌絲干質量。振蕩溫度為24、26、28 ℃；轉速為160、180、200 r/min；振蕩時間為24、48、72 h。

1.2.2棉花黃萎病病菌激活蛋白的提取及原液的設定

激活蛋白的提取參照文獻[11]中的方法進行。依次用無菌水和 0.5 mol/L Tris-HCL緩沖液沖洗菌體去除孢子，抽濾得菌絲體；將菌絲體研磨（冰上操作），每次研磨5 min；在4 ℃下，以15 000 r/min離心15 min，取上清液于沸水中加熱10～15 min，取出置于冰上冷卻5 min；再于4 ℃下，15 000 r/min離心15 min，上清液即為激活蛋白粗提液原液，然后對其進行 SDS-PAGE分析。

1.2.3棉花黃萎病病菌激活蛋白對棉花種子發芽的影響[12]

將棉花黃萎病病菌激活蛋白粗提液原液依次用水稀釋 1 000倍、1 500倍、2 000倍，分別對2個棉花品種的種子浸泡處理 8 h，以清水浸泡作對照。每個處理浸泡種子20粒，重復3次。取出后用濾紙吸干濾液，將種子放在墊有濾紙（用蒸餾水潤濕）的培養皿中，置于人工模擬氣候箱中培養。每隔 24 h 檢測1次種子發芽率和幼根生長情況。

2結果與分析

2.1棉花黃萎病病菌培養條件的優化結果

2.2棉花黃萎病病菌激活蛋白的提取結果

電泳檢測結果顯示，提取蛋白分子量大小分布范圍較廣，其中最為明顯的是在分子量為25 ku附近有1條較為集中的電泳譜帶（圖4）。

2.3棉花黃萎病病菌激活蛋白對棉花種子發芽的影響

2.3.1發芽率

從圖5、圖6可知，在培養2 d后，經激活蛋白1 500倍稀釋液處理的種子發芽率明顯高于其他處理，發芽率高達95%。對于新陸中50號，激活蛋白稀釋液處理的種子發芽率均高于對照，其中1 500倍稀釋液處理的種子發芽率最高，在培養2 d后其發芽率可達95%。

2.3.2胚根生長情況

棉花黃萎病病菌激活蛋白對棉花種子的胚根長、胚根鮮質量、胚根干質量均有一定的影響，用SPSS 18.0軟件處理結果如表1所示。與對照相比，激活蛋白1 000倍稀釋液和1 500倍稀釋液對棉花種子的胚根長、胚根鮮質量、胚根干質量均有提升作用。其中稀釋1 500倍時，激活[CM（25]蛋白對棉花種子胚根生長的促進作用最強，且均達到顯著[CM）]

水平，新陸中11號胚根長 5.36 cm，胚根鮮質量80.56 mg，胚根干質量7.45 mg；新陸中50號胚根長5.12 cm，胚根鮮質量75.67 mg，胚根干質量713 mg。表明棉花黃萎病病菌激活蛋白具有一定的誘導激活活性。

3討論

近年來，從植物病原菌中研究發現了具有誘導植物廣譜抗性和促進植物生長的多功能植物激活蛋白，稱為微生物蛋白農藥[13]。該農藥可通過誘導植物本身的抗病基因表達而起到抗病防蟲、促進生長的作用，對多種作物有效。激活蛋白從培養8 h時產生，到72 h時最多；在培養24 h時出現活性，[FL）]

[14]。

本試驗結果表明，棉花黃萎病病菌的最佳發酵條件為 26 ℃、200 r/min、72 h，在此條件下，菌絲干質量可達 5.88 g/L，這與前人的研究結論[15]相同，同時提供了最佳培養溫度和最佳培養轉速，為棉花黃萎病病菌激活蛋白的批量生產提供了技術依據。

4結論

真菌蛋白的產量取決于其發酵條件。采用液體搖瓶培養法，就棉花黃萎病病菌的發酵條件即培養溫度、轉速、培養時間對產菌量的影響進行了單因素試驗，得到最佳發酵條件為 26 ℃、200 r/min、72 h，為棉花黃萎病病菌激活蛋白的批量生產提供了技術依據。

對棉花黃萎病病菌激活蛋白提取液進行電泳檢測，結果表明，提取蛋白分子量大小分布范圍較廣，其中在分子量為 25 ku 附近有1條較為集中的電泳譜帶，說明本試驗采用的方法適用于提取棉花黃萎病病菌激活蛋白。

激活蛋白對2個不同品種棉花種子的胚根長、胚根鮮質量、胚根干質量均有一定的影響。激活蛋白1 000倍稀釋液和1 500倍稀釋液對棉花種子的胚根長、胚根鮮質量、胚根干質量均有一定的促進作用，當稀釋1 500倍時，激活蛋白對棉花種子胚根生長的促進作用最大，此結果表明棉花黃萎病病菌激活蛋白在稀釋1 500倍時具有高效的誘導激活活性。

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