多重RT—PCR檢測(cè)蝴蝶蘭3種病毒CymMV、ORSV和CMV

涂小云++董小艷 +郭春梅 何俊平 +鮑恩亞

摘要：根據(jù)建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）、齒蘭輪斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）和黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）3種病毒外殼蛋白基因序列保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，以病毒侵染的蝴蝶蘭總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，建立了三重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)該3種病毒的方法。CymMV、ORSV和CMV 3種病毒特異擴(kuò)增的片段分別為561、433、306 bp。用該方法對(duì)17個(gè)疑似病毒感染的蝴蝶蘭樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果13個(gè)材料檢測(cè)出CymMV特異帶，2個(gè)材料檢測(cè)出ORSV病毒特異帶，1個(gè)材料檢測(cè)出CMV病毒特異帶，1個(gè)材料同時(shí)檢測(cè)出CymMV和ORSV病毒2條特異帶，所檢測(cè)的17個(gè)蝴蝶蘭材料未發(fā)現(xiàn)3種病毒復(fù)合侵染的情況。

關(guān)鍵詞：蝴蝶蘭；多重RT-PCR；建蘭花葉病毒；齒蘭輪斑病毒；黃瓜花葉病毒；檢測(cè)方法

中圖分類號(hào)： S436.8+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）05-0091-02

蘭花是一種高價(jià)值的觀賞花卉，但一旦感染病毒，其觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值將受到嚴(yán)重影響。近年來，隨著蘭花國內(nèi)外貿(mào)易和種質(zhì)交流頻率的增加，蘭花病毒病的發(fā)生有蔓延趨勢(shì)。目前，至少有28種病毒可感染蘭科植物，其中我國蘭科植物感染的病毒以建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）、齒蘭輪斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）為主，且這2種病毒復(fù)合感染占多數(shù)，也有少數(shù)蝴蝶蘭感染黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）[1]。CymMV和ORSV主要借助機(jī)械性傷口進(jìn)行傳播，CMV 可借汁液傳染，也可通過蚜蟲傳播。這3種病毒病感染蘭花后可迅速擴(kuò)散，且無有效防治藥劑；因此，有必要建立多種病毒的高效檢測(cè)方法，盡早檢出感病植株并實(shí)施銷毀，避免蘭園大面積受損。

目前檢測(cè)植物體內(nèi)病毒的主要方法有電鏡法、血清學(xué)鑒定和PCR技術(shù)等。其中PCR技術(shù)，尤其是多重PCR，具有快速、便捷、靈敏度高和特異性強(qiáng)等顯著優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于病原微生物的檢測(cè)。多重PCR是在同一反應(yīng)體系中，利用一對(duì)或多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，比普通單重PCR更為高效、經(jīng)濟(jì)和簡(jiǎn)便。鄭軒等在一個(gè)PCR體系中成功對(duì)5種病毒復(fù)合侵染的煙草材料進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增，建立了能同時(shí)檢測(cè)煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、煙草蝕紋病毒、馬鈴薯Y病毒和煙草脈帶花葉病毒的多重PCR檢測(cè)體系[2]。張威等[3]和羅文彬等[4]分別建立了可同時(shí)檢測(cè)馬鈴薯3種病毒和5種病毒的多重PCR方法。

多重PCR在蘭花病毒檢測(cè)的利用主要集中于CymMV和ORSV的雙重檢測(cè)[5-9]，如鄭國華等利用2對(duì)特異引物在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增的方法，建立了二溫式多重 RT-PCR同時(shí)檢測(cè)CymMV和ORSV 2種病毒的方法[8]；章鵬程等利用1對(duì)簡(jiǎn)并引物，通過一步式IC-RT-PCR可以同時(shí)檢測(cè)CymMV和ORSV復(fù)合感染情況[10]。鳳仙花壞死斑病毒（impatiens necrotic spot virus，INSV）和CymMV 2種病毒也可以通過雙重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)[11]。樊榮輝等通過優(yōu)化三重PCR反應(yīng)條件，一次擴(kuò)增能同時(shí)檢測(cè)文心蘭CymMV、ORSV和菜豆黃花葉病毒（bean yellow mosaic virus，BYMV）的特異片段[12]。CymMV、ORSV和蘭花斑點(diǎn)病毒（orchid fleck virus，OFV）的三重PCR檢測(cè)體系最近也已有報(bào)道[13]。但CymMV、ORSV和CMV的三重PCR檢測(cè)體系目前還未見報(bào)道。本研究根據(jù)CymMV、ORSV和CMV外殼蛋白基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，建立了三重RT-PCR檢測(cè)該3種病毒的方法，可準(zhǔn)確快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)出蝴蝶蘭帶毒情況，為盡早發(fā)現(xiàn)、消除病害，減少經(jīng)濟(jì)損失提供了技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料

CymMV、ORSV和CMV 3種病毒2013年采自江蘇省連云港振興實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司的蘭花基地。其他供試蝴蝶蘭材料來源于連云港當(dāng)?shù)鼗ɑ苁袌?chǎng)。

1.2引物設(shè)計(jì)

1.3cDNA獲取

取蝴蝶蘭新鮮葉片，液氮研磨成粉狀，用Trizol RNA試劑盒提取葉片總RNA，然后用Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，隨即保存于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｋ胁僮骶丛噭┖姓f明書進(jìn)行。

1.4單重RT-PCR確定產(chǎn)物的特異性

采用Vazyme Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 μL反應(yīng)體系的組成如下：2× Vazyme mix buffer 10.0 μL，10 μmol/L上游引物和下游引物各 1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，無菌水 7 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；93 ℃變性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5多重RT-PCR檢測(cè)的建立

在單重PCR基礎(chǔ)上，將上述3種cDNA模板等量混合，保持其他條件不變，分別對(duì)模板濃度、退火溫度、引物濃度和循環(huán)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最后確定多重PCR最優(yōu)反應(yīng)體系。采用Vazyme Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 μL反應(yīng)體系的組成如下：2× Vazyme mix Buffer 10.0 μL，10 μmol/L CymMV上游引物和下游引物各 0.8 μL，10 μmol/L ORSV上游引物和下游引物各 0.8 μL，10 μmol/L CMV上游引物和下游引物各 0.5 μL，稀釋10倍的cDNA模板1.0 μL，無菌水4.8 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；93 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2結(jié)果與分析

2.1單重RT-PCR檢測(cè)體系

分別單獨(dú)采用1對(duì)引物對(duì)獲得的蝴蝶蘭cDNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3對(duì)引物均能在相對(duì)于的樣品中獲得預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物（擴(kuò)增產(chǎn)物分別為561、433、306 bp），電泳呈單一明亮條帶（圖1），陰性水對(duì)照沒有陽性條帶，表明檢側(cè)結(jié)果是特異性的，適合用于病毒檢側(cè)。

2.2三重RT-PCR檢測(cè)體系

擴(kuò)增CymMV、ORSV和CMV的3對(duì)引物按等量濃度混合，對(duì)蝴蝶蘭cDNA混合樣品進(jìn)行擴(kuò)增，效果不理想。經(jīng)過系列優(yōu)化后，擴(kuò)增CymMV、ORSV和CMV的3對(duì)引物的濃度比例為CymMV ∶[KG-*3]ORSV ∶[KG-*3]CMV= 1.6 ∶[KG-*3]1.6 ∶[KG-*3]1，蝴蝶蘭cDNA混合樣品稀釋10倍，可以在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中成功擴(kuò)增出3個(gè)利用優(yōu)化后RT-PCR體系，檢測(cè)疑似病毒侵染的17個(gè)蝴蝶蘭材料，結(jié)果如圖3所示：13個(gè)（1～3、5～7、10～13、15～17）材料檢測(cè)出CymMV特異帶，2個(gè)（4、9號(hào)）材料檢測(cè)出ORSV病毒特異帶，1個(gè)（8號(hào)）材料檢測(cè)出CMV病毒特異帶，1個(gè)（14號(hào)）材料檢測(cè)出CymMV和ORSV病毒2條特異帶，陰性水對(duì)照（18號(hào)）無CymMV、ORSV或CMV特異帶。所檢測(cè)的17個(gè)蝴蝶蘭材料未發(fā)現(xiàn)3種病毒復(fù)合侵染的情況。

3討論

普通單重RT-PCR可以對(duì)單一病毒進(jìn)行有效檢測(cè)，但CymMV、ORSV等病毒廣泛分布于世界各地商業(yè)生產(chǎn)的蘭花中，感染30多種蘭屬花卉，且這些病毒還易于形成復(fù)合侵染，嚴(yán)重降低蘭花的商業(yè)價(jià)值[14]。同時(shí)檢測(cè)2種或多種主要蘭花病毒的雙重或多重PCR技術(shù)已有多個(gè)成功的報(bào)道，它們可以降低檢測(cè)成本，縮短病毒檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率，包括針對(duì)CymMV和ORSV的雙重PCR檢測(cè)[5-10]，針對(duì)INSV和CymMV雙重PCR檢測(cè)[11]，針對(duì)CymMV、ORSV和BYMV的三重檢測(cè)[12]，針對(duì)CymMV、ORSV和OFV的三重PCR檢測(cè)體系[13]等。對(duì)于病毒的檢測(cè)，并非所有的病毒都可以用同一種方法檢測(cè)，也沒有一種方法可以檢測(cè)出所有的病毒，應(yīng)根據(jù)所研究的病毒特性及具體的試驗(yàn)條件、科研水平和操作人員的技[CM（25]術(shù)水平選用合適的方法。本研究針對(duì)蝴蝶蘭CymMV、

ORSV和CMV 3種病毒，成功建立了RT-PCR三重檢測(cè)技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)的關(guān)健是要選用合適的引物，在保證引物特異性的前提下，避免引物之間的互作干擾。本研究中所涉及3種病毒外殼蛋白基因序列同源性較高，因而用PCR方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)可獲得較穩(wěn)定可靠的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

[1]蘇俊明，張友強(qiáng). 蝴蝶蘭病毒病發(fā)生與防治（二）[N]. 中國花卉報(bào)，2008-05-24（003）.

[2]鄭軒，成巨龍，趙震，等. 五種煙草病毒TMV、CMV、TEV、PVY及TVBMV的多重RT-PCR同步檢測(cè)[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2011，41（2）：146-153.

[3]張威，白艷菊，范國權(quán)，等. 應(yīng)用三重RT-PCR技術(shù)檢測(cè)三種馬鈴薯病毒[J]. 中國馬鈴薯，2015（3）：162-166.

[4]羅文彬，李華偉，湯浩，等. 馬鈴薯5種病毒多重PCR檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2015，42（2）：280-288.

[5]曾燕君，莫饒，劉志昕，等. 蘭花兩種主要病毒雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21（7）：12-14.

[6]張妙彬，潘麗晶，肖楊，等. 雙重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)蘭花兩種主要病毒的研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，37（5）：166-167，180.[HJ1.75mm]

[7]聞偉剛，譚鐘，崔俊霞. 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)齒蘭環(huán)斑病毒與建蘭花葉病毒[J]. 植物保護(hù)，2009，35（4）：101-104.

[8]鄭國華，明艷林，林德欽，等. 二溫式多重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)兩種主要蘭花病毒的研究[J]. 植物保護(hù)，2007，33（2）：113-115.

[9]周國輝，陳曉琴，李梅輝，等. 雙重一步法RT-PCR同時(shí)檢測(cè)蘭花上的兩種主要病毒[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2004，12（6）：743-744.[ZK）]

[10]章鵬程，陳芝娟，楊科府，等. 一步式IC-RT-PCR同時(shí)檢測(cè)2種蘭花病毒的探討[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（8）：1165-1168.

[11]丁元明，張巧萍，王云月，等. 蘭花上鳳仙花壞死斑病毒和建蘭花葉病毒雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 植物檢疫，2009，23（4）：32-33.

[12]樊榮輝，黃敏玲，鐘淮欽，等. 文心蘭3種主要病毒多重RT-PCR檢測(cè)體系的建立[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015（7）：697-700.

[13]Ali R，Dann A，Cross P，et al. Multiplex RT-PCR detection of three common viruses infecting orchids[J]. Archives of Virology，2014，159（11）：3095-3099.

[14]萬晴姣，李欲軻，馬駿，等. 貴州齒蘭環(huán)斑病毒的分子鑒定[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（8）：96-98.

[FQ）]