多重RT—PCR檢測蝴蝶蘭3種病毒CymMV、ORSV和CMV

涂小云++董小艷 +郭春梅 何俊平 +鮑恩亞

摘要：根據建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）、齒蘭輪斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）和黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）3種病毒外殼蛋白基因序列保守序列設計特異性引物，以病毒侵染的蝴蝶蘭總RNA反轉錄的cDNA為模板進行擴增，建立了三重RT-PCR同時檢測該3種病毒的方法。CymMV、ORSV和CMV 3種病毒特異擴增的片段分別為561、433、306 bp。用該方法對17個疑似病毒感染的蝴蝶蘭樣品進行檢測，結果13個材料檢測出CymMV特異帶，2個材料檢測出ORSV病毒特異帶，1個材料檢測出CMV病毒特異帶，1個材料同時檢測出CymMV和ORSV病毒2條特異帶，所檢測的17個蝴蝶蘭材料未發現3種病毒復合侵染的情況。

關鍵詞：蝴蝶蘭；多重RT-PCR；建蘭花葉病毒；齒蘭輪斑病毒；黃瓜花葉病毒；檢測方法

中圖分類號： S436.8+1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0091-02

蘭花是一種高價值的觀賞花卉，但一旦感染病毒，其觀賞價值和經濟價值將受到嚴重影響。近年來，隨著蘭花國內外貿易和種質交流頻率的增加，蘭花病毒病的發生有蔓延趨勢。目前，至少有28種病毒可感染蘭科植物，其中我國蘭科植物感染的病毒以建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）、齒蘭輪斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）為主，且這2種病毒復合感染占多數，也有少數蝴蝶蘭感染黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）[1]。CymMV和ORSV主要借助機械性傷口進行傳播，CMV 可借汁液傳染，也可通過蚜蟲傳播。這3種病毒病感染蘭花后可迅速擴散，且無有效防治藥劑；因此，有必要建立多種病毒的高效檢測方法，盡早檢出感病植株并實施銷毀，避免蘭園大面積受損。

目前檢測植物體內病毒的主要方法有電鏡法、血清學鑒定和PCR技術等。其中PCR技術，尤其是多重PCR，具有快速、便捷、靈敏度高和特異性強等顯著優點，現已廣泛用于病原微生物的檢測。多重PCR是在同一反應體系中，利用一對或多對引物同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，比普通單重PCR更為高效、經濟和簡便。鄭軒等在一個PCR體系中成功對5種病毒復合侵染的煙草材料進行多重擴增，建立了能同時檢測煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、煙草蝕紋病毒、馬鈴薯Y病毒和煙草脈帶花葉病毒的多重PCR檢測體系[2]。張威等[3]和羅文彬等[4]分別建立了可同時檢測馬鈴薯3種病毒和5種病毒的多重PCR方法。

多重PCR在蘭花病毒檢測的利用主要集中于CymMV和ORSV的雙重檢測[5-9]，如鄭國華等利用2對特異引物在同一個PCR反應體系進行擴增的方法，建立了二溫式多重 RT-PCR同時檢測CymMV和ORSV 2種病毒的方法[8]；章鵬程等利用1對簡并引物，通過一步式IC-RT-PCR可以同時檢測CymMV和ORSV復合感染情況[10]。鳳仙花壞死斑病毒（impatiens necrotic spot virus，INSV）和CymMV 2種病毒也可以通過雙重RT-PCR同時檢測[11]。樊榮輝等通過優化三重PCR反應條件，一次擴增能同時檢測文心蘭CymMV、ORSV和菜豆黃花葉病毒（bean yellow mosaic virus，BYMV）的特異片段[12]。CymMV、ORSV和蘭花斑點病毒（orchid fleck virus，OFV）的三重PCR檢測體系最近也已有報道[13]。但CymMV、ORSV和CMV的三重PCR檢測體系目前還未見報道。本研究根據CymMV、ORSV和CMV外殼蛋白基因序列保守區域設計特異性引物，建立了三重RT-PCR檢測該3種病毒的方法，可準確快速、簡便、經濟地檢測出蝴蝶蘭帶毒情況，為盡早發現、消除病害，減少經濟損失提供了技術支持。

1材料與方法

1.1材料

CymMV、ORSV和CMV 3種病毒2013年采自江蘇省連云港振興實業集團有限公司的蘭花基地。其他供試蝴蝶蘭材料來源于連云港當地花卉市場。

1.2引物設計

1.3cDNA獲取

取蝴蝶蘭新鮮葉片，液氮研磨成粉狀，用Trizol RNA試劑盒提取葉片總RNA，然后用Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）將RNA反轉錄為cDNA第一鏈，隨即保存于-20 ℃備用。所有操作均按試劑盒說明書進行。

1.4單重RT-PCR確定產物的特異性

采用Vazyme Taq DNA聚合酶進行PCR擴增，20 μL反應體系的組成如下：2× Vazyme mix buffer 10.0 μL，10 μmol/L上游引物和下游引物各 1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，無菌水 7 μL。PCR反應程序如下：95 ℃預變性3 min；93 ℃變性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5多重RT-PCR檢測的建立

在單重PCR基礎上，將上述3種cDNA模板等量混合，保持其他條件不變，分別對模板濃度、退火溫度、引物濃度和循環參數進行優化，最后確定多重PCR最優反應體系。采用Vazyme Taq DNA聚合酶進行PCR擴增，20 μL反應體系的組成如下：2× Vazyme mix Buffer 10.0 μL，10 μmol/L CymMV上游引物和下游引物各 0.8 μL，10 μmol/L ORSV上游引物和下游引物各 0.8 μL，10 μmol/L CMV上游引物和下游引物各 0.5 μL，稀釋10倍的cDNA模板1.0 μL，無菌水4.8 μL。PCR反應程序如下：95 ℃預變性3 min；93 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2結果與分析

2.1單重RT-PCR檢測體系

分別單獨采用1對引物對獲得的蝴蝶蘭cDNA樣品進行PCR擴增，3對引物均能在相對于的樣品中獲得預期大小的擴增產物（擴增產物分別為561、433、306 bp），電泳呈單一明亮條帶（圖1），陰性水對照沒有陽性條帶，表明檢側結果是特異性的，適合用于病毒檢側。

2.2三重RT-PCR檢測體系

擴增CymMV、ORSV和CMV的3對引物按等量濃度混合，對蝴蝶蘭cDNA混合樣品進行擴增，效果不理想。經過系列優化后，擴增CymMV、ORSV和CMV的3對引物的濃度比例為CymMV ∶[KG-*3]ORSV ∶[KG-*3]CMV= 1.6 ∶[KG-*3]1.6 ∶[KG-*3]1，蝴蝶蘭cDNA混合樣品稀釋10倍，可以在同一個PCR反應體系中成功擴增出3個利用優化后RT-PCR體系，檢測疑似病毒侵染的17個蝴蝶蘭材料，結果如圖3所示：13個（1～3、5～7、10～13、15～17）材料檢測出CymMV特異帶，2個（4、9號）材料檢測出ORSV病毒特異帶，1個（8號）材料檢測出CMV病毒特異帶，1個（14號）材料檢測出CymMV和ORSV病毒2條特異帶，陰性水對照（18號）無CymMV、ORSV或CMV特異帶。所檢測的17個蝴蝶蘭材料未發現3種病毒復合侵染的情況。

3討論

普通單重RT-PCR可以對單一病毒進行有效檢測，但CymMV、ORSV等病毒廣泛分布于世界各地商業生產的蘭花中，感染30多種蘭屬花卉，且這些病毒還易于形成復合侵染，嚴重降低蘭花的商業價值[14]。同時檢測2種或多種主要蘭花病毒的雙重或多重PCR技術已有多個成功的報道，它們可以降低檢測成本，縮短病毒檢測時間，提高檢測效率，包括針對CymMV和ORSV的雙重PCR檢測[5-10]，針對INSV和CymMV雙重PCR檢測[11]，針對CymMV、ORSV和BYMV的三重檢測[12]，針對CymMV、ORSV和OFV的三重PCR檢測體系[13]等。對于病毒的檢測，并非所有的病毒都可以用同一種方法檢測，也沒有一種方法可以檢測出所有的病毒，應根據所研究的病毒特性及具體的試驗條件、科研水平和操作人員的技[CM（25]術水平選用合適的方法。本研究針對蝴蝶蘭CymMV、

ORSV和CMV 3種病毒，成功建立了RT-PCR三重檢測技術，該項技術的關健是要選用合適的引物，在保證引物特異性的前提下，避免引物之間的互作干擾。本研究中所涉及3種病毒外殼蛋白基因序列同源性較高，因而用PCR方法對其進行檢測可獲得較穩定可靠的結果。

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