新型5-氟尿嘧啶-吲哚菁染料偶合物的合成

王時雨, 張俊娜, 冀 楠, 張婧芳, 何 煒

(第四軍醫大學 藥學院 化學教研室，陜西 西安 710032)

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新型5-氟尿嘧啶-吲哚菁染料偶合物的合成

王時雨, 張俊娜, 冀 楠, 張婧芳, 何 煒*

(第四軍醫大學 藥學院 化學教研室，陜西 西安 710032)

以抗癌藥5-氟尿嘧啶和近紅外熒光探針IR780和IR783為原料，經取代、乙酸化和酰胺化反應合成了兩種新型的雙效抗腫瘤藥物5-FU-780和5-FU-783，其結構經1H NMR，13C NMR， IR和HR-MS表征。

5-氟尿嘧啶; 近紅外熒光探針; IR780; IR783; 5-氟尿嘧啶-吲哚菁染料偶合物; 合成; 抗腫瘤藥物

腫瘤的治療在當今仍然是世界性的難題，準確的診斷和針對性的治療是公認的治療惡性腫瘤最為有效的途徑。近年來，隨著分子影像學的飛速發展，分子影像學技術在區分良惡性組織、尋找微小腫瘤病灶、界定腫瘤范圍和功能成像等方面發揮了重要作用[1-2]。如果能將分子影像學中腫瘤的準確診斷和腫瘤的靶向治療有機結合起來，同時實現腫瘤的成像診斷、治療和療效評價[3]，這將有利于提升惡性腫瘤的診治水平，為腫瘤的診治提供新的思路。

近紅外熒光探針發射波長為700～1 100 nm，具有較小的輻射能，這個波長的光子在機體生物組織內的吸收和散射很少，生物分子自身熒光較弱，可避免背景干擾而獲得較高的分析靈敏度，因而受到研究人員的重視[4]。其中吲哚菁近紅外熒光探針IR780和IR783(Scheme 1)光穩定性和生物安全性較好，而且具有腫瘤組織靶向性，能夠很好地實現肺癌及腎癌等腫瘤細胞的成像[5-7]，是美國食品與藥品監督管理局(FDA)已批準的可用于臨床的重要近紅外熒光染料[8]。

5-氟尿嘧啶(5-FU)作為抗癌治療的首選藥物，已廣泛應用于各種實體腫瘤的治療，尤其是在消化道腫瘤的臨床治療方面占據重要地位[9-11]。如果能將其和近紅外熒光探針做成前體藥物，利用探針的靶向能力攜帶抗腫瘤藥物到達腫瘤部位，在達到腫瘤精確定位的同時提高靶部位藥物的分布，同時實現腫瘤的診斷和治療兩種功能。

Scheme 1

本文以近紅外熒光探針IR為基礎，將5-FU和近紅外熒光探針IR780或IR783進行化學鍵合，以期獲得同時具有腫瘤近紅外成像和靶向治療的新化合物，為后續生物學活性研究奠定基礎。分別以IR780和IR783與哌嗪經取代反應制得IR780-哌嗪(1)和IR783-哌嗪(2)； 5-FU與氯乙酸反應制得5-氟尿嘧啶-1-乙酸(3)； 3分別與1和2經酰胺化反應合成了兩種新型的雙效抗腫瘤藥物5-FU-780(4)和5-FU-783(5)，其結構經1H NMR，13C NMR， IR和HR-MS表征。并對反應條件進行了優化。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

XRC-1型顯微熔點儀(溫度未校正)；MERCURY-PLUS 400型核磁共振儀(CDC13為溶劑，TMS為內標)；IR-750型紅外光譜儀(KBr壓片)；Waters Quatropremier型質譜儀。

IR780和IR783， Sigma-Aldrich公司；哌嗪，5-氟尿嘧啶,氯化亞砜，氯乙酸，1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，百靈威化學試劑公司；其余所用試劑均為化學純或分析純。

1.2 合成

(1) 1的合成[12]

避光保護下將IR780 333 mg(0.5 mmol)溶于新蒸DMF 10 mL中，抽真空氮氣保護，攪拌下加入哌嗪172 mg(2 mmol)的DMF(5 mL)溶液，于80 ℃反應4 h。冷卻至室溫，減壓蒸除DMF，殘余物經硅膠柱層析[洗脫劑：A=V(DCM) ∶V(MeOH)=60 ∶1]純化得藍色固體1 269 mg，產率75%;1H NMR(400 MHz)δ: 7.66(d,J=13.2 Hz, 2H), 7.32～7.26(m, 4H), 7.09(t,J=8.0 Hz, 2H), 6.97(d,J=6.4 Hz, 2H), 5.80(d,J=13.2 Hz, 2H), 3.88(m, 8H), 3.26(t,J=6.0 Hz, 4H), 2.44(t,J=6.0 Hz, 4H), 1.84(m, 6H), 1.68(s, 12H), 1.02(t,J=6.0 Hz, 6H)。

(2) 2的合成[13]

避光條件下將IR783 363 mg(0.5 mmol)溶于新蒸DMF 10 mL中，抽真空氮氣保護，攪拌下加入哌嗪172 mg(2 mmol)的DMF(5 mL)溶液，于80 ℃反應1.5 h。冷卻至室溫，減壓蒸除DMF，殘余物用DCM溶解，過濾除去不溶物，濾液蒸干后經硅膠柱層析(洗脫劑：A=60 ∶1)純化得藍色固體2 178 mg，產率46%;1H NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.73(d,J=13.2 Hz, 2H), 7.43(t,J=8.0 Hz, 2H), 7.36(d,J=7.3 Hz, 2H), 7.26(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.20(t,J=7.3 Hz, 2H), 6.07(d,J=13.2 Hz, 2H), 4.16～4.11(m, 4H), 3.90～3.84(m, 4H), 2.91～2.78(m, 6H), 2.58～2.52(m, 4H), 2.10～1.48(m, 12 H), 1.68(s, 12H)。

(3) 3的合成[14]

在反應瓶中依次加入5-FU 1.30 g(10 mmol)和KOH(20 mmol)的水(10 mL)溶液，攪拌使其溶解；緩慢滴加氯乙酸(10 mmol)的水(10 mL)溶液，滴畢，于60 ℃反應5 h(TLC監測)。冷卻至室溫，用濃鹽酸調至pH 2，冷卻靜置12 h，過濾，沉淀用水(3×20 mL)洗滌，用水重結晶，烘干得針狀白色晶體3 1.63 g，產率87%；1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.53(s, 1H), 10.75(d,J=5.2 Hz, 1H), 7.76(t,J=6.0 Hz, 1H), 4.10(s, 2H)； IRν: 3 198, 1 669, 1 424 cm-1。

(4) 4的合成

將3 120 mg(0.64 mmol)溶于新蒸二氯甲烷(10 mL)中，冷卻至0 ℃，加入EDC·HCl(0.96 mmol)，攪拌3 min，加入1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)(0.96 mmol)，反應25 min；依次加入1 458 mg(0.64 mmol)的DCM(10 mL)溶液和Et3N 0.2 mmol，反應8 h。減壓蒸除溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：A=80 ∶1)純化得藍綠色固體4 423.9 mg，產率76%；1H NMR (400 MHz)δ: 11.12(s, 1H), 8.49(s, 2H), 8.18(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.33(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.23(d,J=6.4 Hz, 2H), 6.68(s, 2H), 5.87(s, 2H), 5.80(d,J=13.6 Hz, 2H), 3.97(s, 1H), 3.87(t,J=8.4 Hz, 2H), 3.65(m, 2H), 3.48(s, 1H), 3.40(t,J=6.6 Hz, 2H), 2.82(s, 1H), 2.44(t,J=6.4 Hz, 1H), 2.02(t,J=5.8 Hz, 6H), 1.84(m, 2H), 1.66(s, 4H), 1.38(t,J=7.2 Hz, 1H), 1.32(d,J=6.8 Hz, 1H), 1.22(m, 2H), 1.10(t,J=7.0 Hz, 12H), 1.04(d,J=7.2 Hz, 2H), 0.90(dd,J=16.0 Hz, 6.8 Hz, 1H);13C NMR(100 MHz)δ: 171.77, 171.40, 169.62, 157.34, 149.61, 143.99, 141.89, 140.37, 138.42, 130.5, 129.58, 125.22, 123.20, 121.33, 111.29, 79.59, 56.07, 48.63, 47.76, 46.15, 45.97, 29.18, 26.07, 22.83, 21.46, 11.67; HR-MSm/z: Calcd for C46H56N6O3FI{[M-I]-}759.973 9, found 759.972 3。

(5) 5的合成

將3 231 mg(1.23 mmol)溶于新蒸DCM(10 mL)中，攪拌下于0 ℃加入EDC·HCl(1.85 mmol)，攪拌3 min；加入HOAt(1.85 mmol)，反應25 min；加入2 953 mg(1.23 mmol)的DCM(20 mL)溶液，加入Et3N(0.37 mmol)，反應8 h。減壓蒸除溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：A=8 ∶1)純化得藍綠色固體5 687 mg，產率60%；1H NMR(400 MHz)δ: 11.09(s, 1H), 8.47(s, 2H), 8.16(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.32(m, 2H), 7.20(m, 3H), 6.99(d,J=8.0 Hz, 1H), 6.78(s, 1H), 5.66(s, 4H), 3.96(s, 2H), 3.70(m, 4H), 3.41(d,J=6.4 Hz, 1H), 2.35(s, 1H), 2.00(s, 8H), 1.88(m, 10H), 1.66～1.43(m, 12H), 1.06(d,J=7.2 Hz, 4H);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 169.71, 169.31, 157.34, 157.03, 149.61, 142.61, 140.70, 140.44, 139.12, 131.15, 128.41, 124.60, 123.74, 122.13, 110.55, 97.61, 54.26, 50.43, 49.03, 48.14, 45.72, 43.41, 28.23, 25.90, 24.89, 22.63, 21.33; HR-MSm/z: Calcd for C48H58N6O9S2F-{[M-I]}946.137 6, found 946.135 9。

2 結果與討論

5-FU-780和5-FU-783的合成中所用原料價廉易得，所用反應均為經典的有機合成反應，但由于菁染料極性較大，在反應的選擇性和后處理方面均存在一定的困難。我們對其中關鍵步驟進行了條件探索，簡化了反應操作過程，有效提高了反應產率。

2.1 1和2的合成

在1和2的合成中，熒光探針IR780和IR783中的氯為活性部位，當和哌嗪反應時，實驗發現哌嗪的用量和反應溫度是影響該反應的關鍵。針對這兩個關鍵條件進行較為深入的考察，實驗結果見表1。

表1 哌嗪用量和反應溫度對產率的影響

由表1可見，當哌嗪用量過大時，副產物比例非常大，難以進行分離純化。實驗還發現，哌嗪用量少時反應難以發生，這可能是由于菁染料分子中氯的位阻較大，少量的仲胺難以進行親核反應。經條件篩選最終確定哌嗪用量為4 eq.，可以順利制得目標產物。

在上述基礎上進一步考察反應溫度對反應的影響，實驗發現在DMF中回流反應時，副產物特別多，降溫至120 ℃，副產物有所減少，于100 ℃反應時TLC顯示仍有3個產物點生成。而在室溫進行反應，混合物中副反應最少，但收率特別低，延長反應時間也未能提高產率。當反應在80 ℃進行時，IR780和哌嗪以75%的分離產率制得目標產物，而IR783的極性較大，和哌嗪的反應副產物更多，純化過程需要多次柱層析才能獲得目標產物，分離產率為46%。

2.2 4和5的合成

3分別與1和2反應合成4和5，該步反應為經典的有機反應，本文選擇常用的EDC·HCl和HOAt作為偶聯劑[15]。實驗中發現只用上述兩種偶聯試劑，而沒有其他堿存在下，該偶聯反應不能發生。因此，本實驗考察了三乙胺、吡啶及碳酸鉀等添加劑促進反應進行，實驗結果見表2。實驗結果發現當以三乙胺為添加劑時，分別以76%和60%的分離產率成功合成目標化合物4和5。

表2 添加劑對產率的影響

在吲哚菁近紅外熒光探針基礎上，通過取代、乙酸化和酰胺化等一系列化學反應將抗癌藥物5-FU與近紅外熒光探針IR780和IR783偶聯，制得同時具有腫瘤近紅外成像和靶向治療的新化合物5-FU-780和5-FU-783，并對其結構進行了表征，為進一步腫瘤診斷與治療研究奠定了基礎。這種基于近紅外熒光探針構建同時具有診斷和靶向治療作用的新型多功能抗腫瘤藥物具有重要的意義，為腫瘤的診療提供了新的思路。

[1] 蔣力揚,孟雪,于金明. 用分子影像指導腫瘤精準治療[J].中華核醫學與分子影像雜志,2016,36(1):3-6.

[2] Hu X D, Xing LG, Yu J M,etal. Nuclear medical molecular imaging of tumor angiogenesis:Current status and future prospect[J].Chin Med J,2013,126(14):2741-2746.

[3] Alberti C. From molecular imaging in preclinical/clinical oncology to theranostic applications in targeted tumor therapy[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2012,16(14):1925-1933.

[4] 劉欣,王紅,張華山. 生物分析中近紅外熒光探針進展[J].分析科學學報,2001,17(4):346-352.

[5] Christy A, Mark M S. Sequence-dependent fluorescence of cyanine dyes on microarrays[J].PLoS One,2011,6(7):e22177.

[6] 孫亮亮.氨基菁類熒光染料用于腫瘤細胞的光學成像[D].大連:大連理工大學,2015.

[7] Foersch S, Heimann A, Ayyad A,etal. Confocal laser endomicroscopy for diagnosis and histomorphologic imaging of brain tumorsinvivo[J]. PLoS One,2012,7(7):e41760.

[8] Jerre W M, Kelly M B. Removal of calcein in waste water produced from the batch marking of fish[J].N Am J Fish Manage,2008,28(4):1177-1181.

[9] Gordon W, Janette V, Malcolm A B,etal. The effects of the anti-cancer drugs,methotrexate and 5-fluorouracil on cognitive function in mice [J].Pharmacol Biochem Behav,2006,85(1):66-75.

[10] He Y S, Sun W, Wang C Z,etal. Effects of American ginseng on pharmacokinetics of 5-fluorouracil in rats[J].2015,29(5):762-767.

[11] 黃文才，張春紅，蘇玉芬，等. 5-氟尿嘧啶靶向性前藥的研究進展[J].華西藥學雜志,2008,23(4):462-465.

[12] Li C Y, Kong X F, Li Y F,etal. Ratiometric and colorimetric fluorescent chemosensor for Ag+based on tricarbocyanine[J].Dyes and Pigment,2013,99:903-907.

[13] Takuya M, Kazuki K, Kenjiro H,etal. Rational design of ratiometric near-infrared fluorescent pH probes with various pKavalues, based on aminocyanine[J].J Am Chem Soc,2011,133(10):3401-3409.

[14] 楊琴，張志榮. 5-氟尿嘧啶-D-氨基葡萄糖衍生物的設計與合成[J].華西藥學雜志,2014,29(4):359-361.

[15] Tellitu I, Serna S, Herrero M T,etal. Intramolecular PIFA-mediated alkyne amidation and carboxylation reaction[J].J Org Chem,2007,72(4):1526-1529.

Synthesis of Novel 5-Fluorouracil-coupled Indocyanine Dye Compounds

WANG Shi-yu, ZHANG Jun-na, JI Nan, ZHANG Jing-fang, HE Wei*

(Department of Chemistry, School of Pharmacy, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

Two new 5-fluorouracil-coupled indocyanine dye compounds(5-FU-780 and 5-FU-783) were synthesizedviasubstitution, acetoxylation and amidation reaction, using antitumor drug 5-fluorouracil and near-infrared fluorescent dyes IR780 and IR783 as the starting materials. The structures were characterized by1H NMR，13C NMR， IR and HR-MS.

5-fluorouracil； near-infrared fluorescent probe； IR780； IR783； 5-fluorouracil-coupled indocyanine dye; synthesis; antitumor drug

2016-11-18

陜西省科技統籌計劃重點項目(2012KTCQ03-02)

王時雨(1992-)，女，漢族，陜西漢中人，碩士研究生，主要從事抗腫瘤藥物合成研究。 Tel. 029-84774470, E-mail: wangshiyuwang@163.com

何煒，教授，博士生導師， Tel. 029-84774470， E-mail: weihechem@fmmu.edu.cn

R979.1； O621.3

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.04.16290