高氯土壤條件下烤煙對(duì) Cl-通道抑制劑的生理響應(yīng)

商靜，許嘉陽，范藝寬，黃五星，許自成*

（1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南鄭州 450002；2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193；3 河南省煙草公司煙草研究所，河南鄭州 472000）

高氯土壤條件下烤煙對(duì) Cl-通道抑制劑的生理響應(yīng)

商靜1，許嘉陽2，范藝寬3，黃五星1，許自成1*

（1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南鄭州 450002；2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193；3 河南省煙草公司煙草研究所，河南鄭州 472000）

【目的】在我國部分煙區(qū)，土壤氯離子含量高是造成煙葉氯離子含量高的一個(gè)主要因素，困擾著當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙草的生產(chǎn)。研究氯離子通道抑制劑對(duì)烤煙成熟期葉片生理指標(biāo)的影響，可為生產(chǎn)中合理降氯提供一定的參考。 【方法】2015 年在河南科技大學(xué)采用盆栽土培試驗(yàn)，設(shè)置四個(gè)處理，分別為 200 μmol/L NFA、200 μmol/L 9-AC、200 μmol/L Zn2+和蒸餾水，土壤含氯量為 50 mg/kg。于移栽后 30、45、60、75 d 灌根，每個(gè)處理每次每盆灌 1 L，連灌 3 天。測定了成熟期烤煙中部功能葉片中的 CLC-Nt2 基因表達(dá)強(qiáng)度、光合色素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、相關(guān)元素積累量以及煙株生物量。 【結(jié)果】1) 與對(duì)照相比，施用抑制劑 Zn2+、NFA、9-AC 的煙株葉片中 CLC-Nt2 的表達(dá)量顯著降低，分別為對(duì)照的 82.22%、75.39%、72.19%，但 3 組抑制劑處理之間無顯著差異。2) Zn2+、NFA、9-AC 處理的葉片葉綠素總含量較對(duì)照分別增加 20.15%、29.10%、45.52%，差異達(dá)到顯著水平。同時(shí)，經(jīng)不同抑制劑處理的葉片葉綠素?zé)晒馓匦砸脖憩F(xiàn)出不同程度的增加，表明抑制劑可以減緩氯含量對(duì)烤煙 PSⅡ光合機(jī)構(gòu)的傷害。3) 抑制劑對(duì)烤煙葉片中 Cl-、K+、NO3-的積累有明顯影響。與對(duì)照相比，抑制劑處理的 3 組葉片中 Cl-含量顯著降低，降幅在 18.17%～33.48%；K+含量和 NO3-含量明顯提高，增幅分別為

Cl-通道抑制劑；烤煙；生理響應(yīng)

煙草是一種對(duì)氯吸收具有“奢侈”特性的植物[1]，葉片氯含量與土壤供氯量直接相關(guān)[2-4]；同時(shí)，煙草也是一種“忌氯植物”，過量的氯不僅會(huì)影響烤煙的生理作用[5-6]，還會(huì)導(dǎo)致烤后的煙葉雜氣重，香吃味差，燃燒性下降甚至熄火，焦油含量高，安全性低，煙葉的品質(zhì)急劇下降[7-8]。黃淮海煙區(qū)和西北煙區(qū)是我國土壤氯含量較高的兩大煙區(qū)，煙葉氯含量高的問題一直沒有得到很好解決。目前，降低烤煙氯含量的措施主要有兩個(gè)方面:一是選擇合理的耕作制度，選擇對(duì)氯敏感的作物，如馬鈴薯、甜菜、小麥等作為煙草的前作；選擇喜氯作物，如甘藍(lán)、堿蓬、萵苣等與烤煙間作、套作。二是優(yōu)化大田管理措施，選擇合適作物進(jìn)行秸稈覆蓋；減少使用含氯的灌溉水，適時(shí)澆水，杜絕大水漫灌；施用不含氯的化肥和農(nóng)藥[9]。由于耕地面積有限，實(shí)際生產(chǎn)中操作不到位，土壤中氯離子來源廣等原因，土壤中氯含量未能得到有效降低，再加上煙株對(duì)氯的奢侈吸收，煙葉降氯效果一直不理想。

氯離子通道家族，是定位于生物膜上的一大類跨膜蛋白家族，主要參與植物體內(nèi) Cl-離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及膜電勢等生理功能[10]。有研究表明，鹽害下，選擇合適的 Cl-通道抑制劑，可在一定程度上降低植物對(duì)氯素的吸收，緩解過量氯害對(duì)植物的傷害作用[11]。常用的 Cl-通道抑制劑有 Zn2+、NFA (尼氟滅酸)、9-AC (蒽-9-羧酸)、DIDS (4, 4′-二異硫氰基-2, 2′-二磺酸鹽)、CCCP (間-氯苯腙羰基氰化物)等[12-13]。目前，關(guān)于施用不同種類抑制劑對(duì)煙株生理指標(biāo)的影響研究尚未見報(bào)道。為此本試驗(yàn)以烤煙為試材，研究施用抑制劑NFA、9-AC 和 Zn2+對(duì)烤煙氯離子通道蛋白基因、光合色素含量、葉綠素?zé)晒狻⑾嚓P(guān)元素含量以及生物量的影響，為降低土壤中過量的氯素對(duì)煙草生長發(fā)育的不良影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于 2015 年在河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)場進(jìn)行，供試煙草 (Nicotiana tabacum L.) 品種為‘豫煙10 號(hào)’。供試土壤類型為褐土，質(zhì)地為砂壤土，土壤 pH 值為 7.5，有機(jī)質(zhì)為 20.3 g/kg，堿解氮為 68.3 mg/kg， 速 效 磷 為 15.7 mg/kg， 速 效 鉀 為119.5 mg/kg，水溶性 Cl-為 20.8 mg/kg。盆栽采用內(nèi)徑 40 cm、高 35 cm 的塑料盆，每盆裝土 20.0 kg。移栽前保持每盆 Cl-含量為 50 mg/kg (一般植煙最適宜區(qū)域土壤 Cl-含量不超過 30 mg/kg[14])，土壤氯含量不足時(shí)以分析純 KCl 補(bǔ)充。每盆施純 N 5.0 g，各處理N∶P2O5∶K2O 配比均為 1∶1.5∶3。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)共設(shè) 4 個(gè)處理，NFA 200 μmol/L、9-AC 200 μmol/L、Zn2+200 μmol/L，以蒸餾水處理作為對(duì)照(CK)。每個(gè)處理總計(jì)種植 25 盆，分別于移栽后 30、45、60、75 d 進(jìn)行抑制劑灌根處理 (各個(gè)時(shí)期每天 1 L 一次性灌完，連灌 3 天，灌根時(shí)間為 16∶00～17∶00 pm)。移栽后 80 d，隨機(jī)采集不同處理烤煙植株中部功能葉片，并迅速置于液氮中，-80℃ 保存?zhèn)溆茫訒r(shí)每個(gè)處理重復(fù) 3 次。

1.3 測定項(xiàng)目和方法

1.3.1PCR 和 熒 光 定 量PCR 按 照 Trizol 試 劑(Invitrogen) 使用說明書提取鮮煙葉樣品的總 RNA，利 用1.0% 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測 完 整 度 。 參 考Fermentas First Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行 cDNA 的合成。運(yùn)用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物序列，并由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。引物序列見表 1。其中選擇煙草beta-Actin 作為內(nèi)參基因。利用 SYBR Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus) TAKARA：RR820A 試劑盒 (寶生物工程·大連有限公司) 在 Step One PlusTM型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀 (Applied Biosystems，USA)上進(jìn)行反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系為 20 μL，包括 2 × SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10.0 μL，10 μmol/LForward primer 0.8 mL，10 μmol/LReverse primer 0.8 μL，50 × ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA template 2.0 μL，dH2O 6.0 μL。PCR 反應(yīng)程序:95℃ 1 min，95℃ 30 s，57℃ 30 s；72℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后利用熔解曲線檢測產(chǎn)物特異性:95℃ 15 s，60℃ 1 min，從 60℃ 緩慢升溫至 95℃，每次上升 0.3℃。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.2光合色素的測定 葉綠素及類胡蘿卜素采用95% 乙醇提取法[15]測定。

1.3.3葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 移栽后 80 d，于晴天上午 9∶00～11∶00，采用 FMS2 脈沖調(diào)制式熒光儀(英國 Hansatech)，測定暗適應(yīng)下最大熒光 (Fm)、初始熒光 (Fo) 以及光適應(yīng)下穩(wěn)態(tài)熒光 (Fs)、初始熒光(Fo')、最大熒光 (Fm') 等熒光參數(shù)，參照 Genty 等[16]的方法及 FMS2 型葉綠素?zé)晒鈨x使用手冊(cè)，計(jì)算: PSⅡ潛在活性 (Fv/Fo) = (Fm-Fo)/Fo，PSⅡ最大光化學(xué)效率 (Fv/Fm) = (Fm-Fo)/Fm，PSⅡ量子效率(ФPS Ⅱ) = (Fm'-Fs)/Fm'， 光 化 學(xué) 淬 滅 系 數(shù)(qP) = (Fm'-Fs)/(Fm'-Fo')， 非 光 化 學(xué) 淬 滅 系 數(shù) (NPQ) = (Fm-Fm')/Fm' 等。以上指標(biāo)的測定選取受光方向一致的中部功能葉片，每處理重復(fù)測定 5 片葉。

1.3.4植物干重的測定 在煙株移栽 80 d 時(shí)，每處理隨機(jī)選取 3 株，用去離子水反復(fù)沖洗干凈烤煙植株。將根、莖、葉分開，于 105℃ 殺青 15 min，70℃ 烘干至恒重后稱重，計(jì)算總干重、根冠比。

1.3.5K+、Cl-、NO3-的測定 將烘干的煙樣磨碎，過60 目篩。K+含量采用 YC/T217-2007 法測定[17]；Cl-含 量 采 用 YC/T162-2002 測 定[18]； NO3--N 采 用Cataldo 的水楊酸法測定[19]。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)選擇 Ct 值比較法 (2-ΔΔCt法) 進(jìn)行計(jì)算，假設(shè)對(duì)照的目的基因表達(dá)量為 1，在不同抑制劑處理下目的基因的表達(dá)量是對(duì)照的 F 倍，則 F = 2-ΔΔCt，其中 ΔΔCt = 處理 (CtCLC-Nt2 - CtActin) - 對(duì)照 (CtCLCNt2 - CtActin)。

運(yùn)用 SPSS20.0 和 Microsoft Excel 2013 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。采用 Duncan 新復(fù)極差測驗(yàn)法 (P ＜0.05) 進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同 Cl-通道抑制劑對(duì)烤煙氯離子通道蛋白CLC-Nt2 基因表達(dá)的影響

2.1.1總 RNA 質(zhì)量檢測 提取的總 RNA 經(jīng) 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定，28S rRNA 和 18S rRNA 條帶清晰可見，無明顯降解 (圖 1)，說明提取的總RNA 完整性良好，滿足實(shí)驗(yàn)需求。

圖1 烤煙葉片總 RNA 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Total RNA of flue-cured tobacco leaves in 1.0% agarose gel electrophoresis

2.1.2不同處理烤煙葉片 CLC-Nt2 基因表達(dá)差異CLC-Nt2 基因是一種重要的陰離子通道蛋白，通過電勢梯度和信號(hào)傳遞等方式參與 Cl-、NO3-和 HCO3-等陰離子的運(yùn)輸[20]。由圖 2 可知，與對(duì)照相比，施用抑制劑的煙葉 CLC-Nt2 基因的表達(dá)量均顯著降低 (P ＜0.05)，但 3 組抑制劑處理之間差異不顯著。

圖2 不同 Cl-通道抑制劑處理烤煙葉片 CLC-Nt2 基因表達(dá)Fig. 2 Expression of CLC-Nt2 gene under different chloride channel inhibitors in flue-cured tobacco leaves[注（Note）:方柱上不同字母表示不同處理間差異顯著 (P ＜0.05) Different letters above the bars indicate significant difference among treatments at the 0.05 level.]

2.2 不同 Cl-通道抑制劑對(duì)烤煙葉片光合色素含量的影響

如表 2 所示，所有抑制劑處理的葉綠素 a、葉綠素 b、總?cè)~綠素含量均顯著高于對(duì)照 (P ＜ 0.05)，在200 μmol/L Zn2+、200 μmol/LNFA、200 μmol/L 9-AC抑制劑處理下的植株與對(duì)照相比，葉綠素 a 的含量分別增加了 14.42%、24.04%、36.54%，葉綠素 b 的含量分別增加了 43.33%、50.0%、73.33%，葉綠素(a + b) 的含量分別增加了 20.15%、29.10%、45.52%。而葉綠素 a/b 值則顯著低于對(duì)照組 (P ＜ 0.05)，這可能是因?yàn)橐种苿?duì)葉綠素 a 和葉綠素 b 含量提高的程度不同引起的。類胡蘿卜素含量除了施用 9-AC 的處理顯著提高外，其他處理雖有所上升，但與對(duì)照相比差異不明顯。

2.3 不同 Cl-通道抑制劑對(duì)烤煙葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.3.1對(duì)烤煙葉片 Fv/Fo 和 Fv/Fm 的影響 Fv/Fo、Fv/Fm 是 表 征 光 化 學(xué) 反 應(yīng) 狀 況 的 兩 個(gè) 重 要 參 數(shù) 。Fv/Fo 一般用于度量 PSⅡ的潛在活性；Fv/Fm 則代表 PSⅡ的最大光化學(xué)效率，一定程度上反映了光抑制程度[21]。Fv/Fo 和 Fv/Fm 在四個(gè)處理間表現(xiàn)出相同的變化趨勢，即 9-AC ＞ NFA ＞ Zn2+＞ CK。其中 9-AC 處理和 NFA 處理的葉片 Fv/Fo、Fv/Fm 值均與對(duì)照差異顯著 (P ＜ 0.05)，施 Zn2+的處理 Fv/Fm 顯著高于對(duì)照，而 Fv/Fo 與對(duì)照相比則差異不明顯。但Fv/Fo、Fv/Fm 在 3 種抑制劑處理間差異不顯著。

2.3.2對(duì) 烤 煙 葉 片 ФPSII、qP 和 NPQ 的 影 響

PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率 (ФPSⅡ)，反映了在 PSⅡ反應(yīng)中心部分關(guān)閉的情況下，實(shí)際 PSⅡ光能捕獲的效率[21]，是衡量植物光合能力的一個(gè)重要指標(biāo)。光化學(xué)淬滅系數(shù) (qP) 反映了 PSⅡ天線色素吸收的光能用于光合電子傳遞的份額，代表了 PSⅡ反應(yīng)中心開放的程度；非光化學(xué)淬滅系數(shù) (NPQ) 反映了不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的光能，它是一種自我保護(hù)機(jī)制，及時(shí)地將過量的光能耗散，起到保護(hù)光合機(jī)構(gòu)的作用[22-24]。由表 3 可知，抑制劑處理烤煙葉片的 ФPSⅡ分別比對(duì)照提高 23.16%、26.28%、32.97%，其中 NFA 和 9-AC 處理均與對(duì)照達(dá)到顯著差異 (P ＜ 0.05)，但 3 種抑制劑處理間差異不顯著。抑制劑處理的 qP 分別比對(duì)照提高 16.27%、20.60%、26.17%，且都達(dá)到顯著水平 (P ＜ 0.05)，其中 9-AC與 Zn2+處理之間差異顯著 (P ＜ 0.05)，而 NFA 處理的 qP 與兩處理差異均不顯著。抑制劑處理的 NPQ分別比對(duì)照提高 13.11%、10.52%、9.42%，但均未達(dá)到顯著水平。

表2 不同抑制劑處理烤煙葉片光合色素含量 (mg/g)Table 2 Effects of different inhibitors on photosynthetic pigment contents in flue-cured tobacco leaves

表3 不同抑制劑處理烤煙葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)Table 3 Parameters of chlorophyll fluorescence of flue-cured tobacco leaves under different inhibitors

2.4 不同 Cl-通道抑制劑對(duì)烤煙 K+、Cl-、NO3-以及 K/Cl 的影響

由表 4 可以看出，與對(duì)照相比，外施 200 μmol/L抑制劑的 3 個(gè)處理 Zn2+、NFA、9-AC，Cl-含量顯著下降，K+含量以及 K/Cl 顯著上升，NO3-含量不同程度 的 增 加 。 其 中 ，Cl-含 量 分 別 降 低 了18.17%、20.76%、33.48%，K+含量分別提高 5.28%、8.28%、10.20%，K/Cl 分別提高 8.72%、36.62%、65.59%，且均與對(duì)照達(dá)到顯著差異 (P ＜ 0.05)；NO3-含量分別提高 12.19%、19.09%、25.24%，其中 NFA 和 9-AC處理與對(duì)照差異顯著 (P ＜ 0.05)。整體上四個(gè)處理的作用效果表現(xiàn)為 9-AC ＞ NFA ＞ Zn2+＞ CK。

2.5 不同 Cl-通道抑制劑對(duì)烤煙生物量的影響

由表 5 可知，與對(duì)照相比，3 種抑制劑處理的煙株莖、葉、總干重顯著提高 (P ＜ 0.05)，根冠比顯著降低 (P ＜ 0.05)，根干重均增加，但僅施用 9-AC 的根干重達(dá)到顯著差異水平 (P ＜ 0.05)。不同抑制劑處理之間，9-AC 處理的根、莖、葉各部分物質(zhì)積累量以及總干重最多，NFA 次之。其中，在根和莖干物質(zhì)積累中，3 種抑制劑處理間差異不顯著，在葉干物質(zhì)和總干重上卻表現(xiàn)出一致的規(guī)律性，即 9-AC 處理明顯高于施 Zn2+處理，且達(dá)到顯著水平 (P ＜ 0.05)，NFA 處理與兩處理差異均不顯著，在根冠比上 NFA和 9-AC 間差異不明顯，但均比施用 Zn2+的根冠比低，且都達(dá)到顯著水平 (P ＜ 0.05)。

表4 不同抑制劑處理烤煙葉片 K+、Cl-、NO3-含量以及 K/Cl 比Table 4 Contents of K+, Cl-, NO3-and K/Cl ratio in flue-cured tobacco leaves affected by different inhibitors

表5 不同抑制劑處理烤煙干物質(zhì)積累量及根冠比Table 5 Dry matter accumulation in flue-cured tobacco affected by different inhibitors

3 討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，植物 CLC 家族能夠參與鹽脅迫下 Cl-平衡，這表明該蛋白家族在植物的耐氯生 理 中 有 潛 在 的 功 能[25-26]。 本 試 驗(yàn) 采 用 實(shí) 時(shí) 熒 光(SYBR Green I 染料) 定量檢測的方法檢測 CLC-Nt2基因在烤煙葉片中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)施用 200 μmol/L 的Cl-離子通道抑制劑能抑制 Cl-離子通道蛋白 CLCNt2 基因在 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，說明該基因在 Cl-離子運(yùn)輸過程中具有重要的作用。

葉綠素包括葉綠素 a 和葉綠素 b，其中葉綠素 a有利于吸收長波光，葉綠素 b 有利于吸收短波光，它們是光合作用中最重要、最有效的色素，其含量的高低直接影響著植物光合作用的強(qiáng)弱及有機(jī)物質(zhì)的合成[27-28]。類胡蘿卜素是光合作用的輔助色素，幫助葉綠素接收光能，同時(shí)還可在強(qiáng)光下逸散能量，保護(hù)葉綠素分子在強(qiáng)光下不致被光氧化而破壞[29]。鹽脅迫能引起植物體內(nèi)葉綠素的降解[30-32]，楊穎麗等[33]也指出，鹽脅迫不僅能引起小麥葉片葉綠素 a、葉綠素 b 和葉綠素總量的減少，而且對(duì)葉綠素 b 的破壞程度明顯強(qiáng)于對(duì)葉綠素 a。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在植煙土壤含 Cl-較高的條件下，施用抑制劑的處理葉綠素 a、葉綠素 b、葉綠素總量都增加，且與對(duì)照相比均達(dá)到顯著水平。造成葉綠素含量上升的原因可能與抑制劑有效阻止大量的 Cl-離子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，降低細(xì)胞膜脂過氧化程度，緩解了葉綠素的分解有關(guān)[34]。其中葉綠素 b 作為一種天線色素，它含量的升高，更有利于增強(qiáng)葉綠體的捕光能力，相對(duì)提高煙株的光能利用率[21]。高氯條件下，施用抑制劑更有利于煙株對(duì)短波光的吸收，即對(duì)葉綠素 b 的促進(jìn)作用更明顯，因此，葉綠素 a/b 值顯著低于對(duì)照。類胡蘿卜素含量在整個(gè)試驗(yàn)中保持了穩(wěn)定，說明相比葉綠素，抑制劑對(duì)類胡蘿卜素的促進(jìn)作用不明顯。抑制劑在整體上提高了光合色素含量，有利于高氯條件下烤煙葉片對(duì)光合電子的捕獲和傳遞。

葉綠素?zé)晒馐枪夂献饔玫奶结槪ㄟ^分析葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化，可以探明光合機(jī)構(gòu)受影響的部位[23,35]。 Belkhodja 等[36]研 究 發(fā) 現(xiàn) ， 鹽 脅 迫 下 大 麥Fv/Fm 和 qP 降低；吳雪霞等[37]以番茄幼苗為研究對(duì)象，結(jié)果表明，NaCl 處理使 Fo 顯著上升，F(xiàn)m、Fv/Fo 和 Fv/Fm、ETR 和 ΦPSⅡ均降低；李青云等[38]指出，鹽脅迫下草莓葉片的 Fv/Fo 值、Fv/Fm 值均呈下降趨勢。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在較高氯條件下，外施 200 μmol/LCl-離子通道抑制劑可引起 Fv/Fo、Fv/Fm、ФPSII、qP、NPQ 等熒光參數(shù)不同程度的增加。其中 Fv/Fo、Fv/Fm 的增加，說明抑制劑減緩了高氯對(duì)烤煙 PSⅡ原初光化學(xué)活性的抑制，提高了PSⅡ潛在活性；ФPSII 和 qP 的增加，則提高了葉片ФPSⅡ反應(yīng)中心開放部分的比例，將更多的光能用于光化學(xué)傳遞，從而提高光合電子傳遞效率；NPQ值增大，則說明抑制劑增強(qiáng)了煙株的熱能耗散能力，在一定程度上起到保護(hù)光合機(jī)構(gòu)的作用。

在植煙土壤含 Cl-較高的條件下，外施 Cl-通道抑制劑 200 μmol/L，能夠顯著影響烤煙葉片中 K+、Cl-、NO3-以及 K/Cl 的值。本研究結(jié)果表明，外施抑制劑，能夠顯著降低 Cl-含量，與烤煙葉片中 CLCNt2 基因表達(dá)強(qiáng)度的結(jié)果一致，說明葉片中 Cl-含量的降低，可能是由于 CLC-Nt2 基因表達(dá)減弱引起的。外施抑制劑的處理，烤煙葉片中 NO3-的含量明顯增加，這可能是因?yàn)?Cl-與 NO3-離子之間有拮抗作用[11]，抑制劑在降低 Cl-吸收的同時(shí)促進(jìn)其對(duì) NO3-吸收和積累。同時(shí)，與對(duì)照相比，K+含量上升，但K+增加的幅度遠(yuǎn)小于 Cl-降低的幅度。抑制劑顯著降低了 Cl-含量，促進(jìn)了植株對(duì) K+的吸收，進(jìn)而引起 K/Cl 值的顯著增加。高氯條件下，施用抑制劑Zn2+，引起烤煙葉片 Cl-含量降低，K+和 NO3-含量上升的結(jié)果與屈婭娜等[11]以大豆為材料，得到的鹽脅迫下施用 Zn2+后，大豆幼苗體內(nèi) Cl-含量降低，K+和 NO3-含量上升的結(jié)果一致，但是 NFA 的結(jié)果正好相反。可能是因?yàn)橐种苿┳饔眯Ч蜓芯课锓N不同、濃度效應(yīng)不同而有所差異。

根冠比反映了植物在一定環(huán)境條件下的生物量分配策略[39]。高氯條件下，由于烤煙各部位對(duì)抑制劑的敏感性不同，導(dǎo)致了生物量分配的變化。施用抑制劑處理的烤煙根冠比顯著低于對(duì)照，而地上部生物量以及總干重則顯著高于對(duì)照，3 種抑制劑處理之間葉片中干物質(zhì)積累量更是達(dá)到顯著水平。這可能是因?yàn)橥庠匆种苿?duì)地上部的影響大于根部，施用抑制劑后烤煙葉片光合色素含量增加，光化學(xué)活性增強(qiáng)，葉片合成和積累有機(jī)物的能力提高，但是向根系輸入的同化物量則較為穩(wěn)定。

4 結(jié)論

當(dāng)植煙土壤中 Cl-濃度較高時(shí)，外施氯離子通道抑制劑能夠?qū)緹熤仓晟L以及體內(nèi)一系列生理活動(dòng)產(chǎn)生積極影響。施用抑制劑能有效降低烤煙葉片CLC-Nt2 基因的表達(dá)強(qiáng)度，提高葉片光合色素含量，維持較高的 PSⅡ穩(wěn)定性，為光合作用提供充足光能，增強(qiáng)植株干物質(zhì)積累能力，還能在降低 Cl-含量的同時(shí)提高 K+和 NO3-的積累。其中，9-AC 處理的煙株整體表現(xiàn)最優(yōu)，而施用 Zn2+的處理在基本滿足降低葉片氯離子含量的同時(shí)降低了生產(chǎn)成本，為生產(chǎn)過程中合理降氯提供參考。氯離子通道抑制劑對(duì)植物的作用效果比較復(fù)雜，在作用的過程中可能不僅受到來自土壤養(yǎng)分、氣候因子等自然因素的影響，還可能因施用濃度、植物種類的不同而異，因此，作用效果還需經(jīng)過實(shí)際生產(chǎn)加以驗(yàn)證。有關(guān)氯離子通道抑制劑的作用機(jī)制及其對(duì)植物品質(zhì)的影響有待進(jìn)一步的探討。

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Physiological responses of flue-cured tobacco under the high chloride to chloride channel inhibitors

SHANG Jing1, XU Jia-yang2, FAN Yi-kuan3, HUANG Wu-xing1, XU Zi-cheng1*
( 1 College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2 Agronomy and Biotechnology College, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 3 Tobacco Research Institute of Henan Provincial Tobacco Company, Zhengzhou 472000, China )

【Objectives】High Cl-content in soil is one of the main factors for high Cl-content in tobacco leaves, which plagues tobacco production in some tobacco-growing area of China. Studying the effect of Clchannel inhibitors on the physiological and biological indexes of flue-cured tobacco would provide reference for approaching reasonable way of relieving the adverse impaction in tobacco production. 【Methods】Three Clinhibitors, Zn2+, NFA and 9-AC, were tested in a pot experiment, in which the used soil Cl-content was 50 mg/kg. All the three Cl-inhibitors were made into water solution of 200 μmol/L, each time irrigated 1 L per pot andconsecutively for 3 days after the tobacco plants were transplanted for 30, 45, 60 and 75 days. The expression of CLC-Nt2 gene, photosynthetic pigments content, chlorophyll fluorescence parameters, the related elements accumulation and plant biomass were measured in maturing leaves. 【Results】1) There was no significant difference in the expressions of CLC-Nt2 gene in tobacco leaves among the Zn2+, NFA and 9-AC treatments, but they were all significantly lower than those in control, which were 82.22%, 75.39% and 72.19% respectively. 2) Inhibitor treatments could obviously raise the content of chlorophyll, with the increasing rate of 20.15% (Zn2+), 29.10% (NFA) and 45.52% (9-AC) separately compared with CK. The chlorophyll fluorescence in each treatment was higher than the control to a certain degree, which had remarkable benefit to decrease the damage of the PSⅡphotosynthetic apparatus in tobacco leaves. 3) Compared with control, the leaf Cl-contents were significantly decreased by 18.17%～33.48%, while the K+and NO3-were apparently increased by 5.28%-10.20% and 12.19%-25.24%, with the best effect in 9-AC. 4) Tobacco biomass were significantly affected by the use of inhibitors. Compared with CK, the dry weight of leaf, stem and the total biomass were significantly promoted and increased by 17.02%-32.45%, 10.54%-20.66% and 13.21%-25.50%, while the root dry weight increased only by 5.94%-11.43%. Therefore, the root-shoot ratio was comparatively lower. The biomass was showed in the order of 9-AC ＞ NFA ＞ Zn2+＞ CK. 【Conclusions】Irrigation of chloride channel inhibitors can alleviate chloride damage to tobacco plants planted in soil with relatively higher Cl-content, because of the positive reactions to growth and physiological activities of flue-cured tobacco. 200 μmol/L 9-AC shows the best performance in the experimental condition, 200 μmol/L Zn2+could meet the needs of reduction of chlorine ion in tobacco leaves with low cost in practice.

chloride channel inhibitors; flue-cured tobacco; physiological responses

2016-05-09 接受日期：2016-06-22

國家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（31200393）；中國煙草總公司河南省公司重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（HYKJ201405）資助。

商靜（1990—），女，河南安陽人，碩士研究生，主要從事煙草營養(yǎng)生理學(xué)研究。E-mail:shangjingyc@163.com

* 通信作者 E-mail:zichengxu@126.com

5.28%～10.20% 和 12.19%～25.24%，其中以 9-AC 處理的效果最佳。4) 抑制劑對(duì)烤煙生物量的合成有促進(jìn)作用。與對(duì)照相比，施用抑制劑后煙株葉、莖、總干重顯著提高，增幅分別為 17.02%～32.45%、10.54%～20.66%和 13.21%～25.50%；而根干重增加幅度較小，僅為 5.94%～11.43%，根冠比顯著降低。抑制劑的作用效果表現(xiàn)為 9-AC ＞ NFA ＞ Zn2+＞ CK。 【結(jié)論】當(dāng)植煙土壤中氯離子含量較高時(shí)，外施氯離子通道抑制劑能夠?qū)緹熤仓晟L及體內(nèi)一系列生理活動(dòng)產(chǎn)生積極作用，在一定程度上緩解了氯害對(duì)煙草的不利影響。在本試驗(yàn)條件下，施用 200 μmol/L 9-AC 的煙株整體表現(xiàn)最優(yōu)，而施用 200 μmol/L Zn2+的處理在基本滿足降低葉片氯離子含量的同時(shí)降低了生產(chǎn)成本，這為生產(chǎn)中合理降氯提供了一定的參考。