氨基化磁性納米粒子捕獲基因組DNA結(jié)合PCR快速檢測牛奶中金黃色葡萄球菌

崔 妍,白亞龍,施春雷,王大鵬,史賢明

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，中美食品安全聯(lián)合研究中心，微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240)

氨基化磁性納米粒子捕獲基因組DNA結(jié)合PCR快速檢測牛奶中金黃色葡萄球菌

崔 妍,白亞龍,施春雷,王大鵬,史賢明*

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，中美食品安全聯(lián)合研究中心，微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240)

本研究對氨基化磁性納米粒子進(jìn)行優(yōu)化,再用優(yōu)化后的納米粒子分離牛奶樣品中微量的金黃色葡萄球菌基因組DNA,結(jié)合PCR檢測,可以達(dá)到100 CFU/mL的檢測限。在此過程中,納米粒子與DNA的復(fù)合物直接加入到PCR體系中進(jìn)行檢測,無需洗脫、純化等步驟,這樣既減少了操作步驟,也減少了DNA損耗,還起到了濃縮的作用。而且,此方法中納米粒子無需抗體等生物分子標(biāo)記,成本非常低廉,在生命物質(zhì)的快速檢測中具有廣闊的前景與巨大的潛力。

氨基化磁性納米粒子,金黃色葡萄球菌,PCR,DNA,磁性分離

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可以在短至幾十分鐘內(nèi)將目標(biāo)DNA片段進(jìn)行百萬倍以上的擴(kuò)增,目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于致病菌檢測[1-3]。然而,僅僅應(yīng)用PCR技術(shù)并不能真正實現(xiàn)食源性致病菌快速檢測。因為食品成分復(fù)雜,目前的DNA純化技術(shù)主要是針對較高濃度的菌液樣品,而且有些DNA純化方法分離得到的產(chǎn)物仍然具有各種PCR抑制物,進(jìn)而導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。因此,一般采取的方法是在PCR檢測之前對食品樣品中的致病菌進(jìn)行增菌培養(yǎng),然而這樣檢測時間又會被較大幅度的增加。另一種可選的方法是在PCR之前對致病菌(或者致病菌DNA)進(jìn)行分離與濃縮。

目前比較成功的磁性分離致病菌的方法主要是免疫磁珠法[4-5],它是在磁性納米粒子上標(biāo)記了相應(yīng)的抗致病菌抗體,通過抗原與抗體的特異性結(jié)合從而捕獲到目標(biāo)致病菌,然后通過磁性分離將目標(biāo)菌體分離與富集。這種分離方法完全依賴于抗致病菌抗體的性能,然而,優(yōu)異的抗致病菌抗體價格昂貴,往往難以獲得。致病菌自身極為復(fù)雜,菌體表面具有大量的抗原表位,而且有些致病菌血清型復(fù)雜,極易出現(xiàn)抗體不能適用于所有菌株的風(fēng)險。此外,一種抗體對應(yīng)一種致病菌,多種致病菌檢測則需要多種致病菌抗體。因此,本研究旨在將食品經(jīng)過簡單處理,直接從中磁性分離致病菌基因組DNA,從而實現(xiàn)致病菌檢測的目的,這樣可以使得檢測成本顯著降低。

目前比較成熟的磁性粒子純化DNA的方法主要是利用硅包磁性納米粒子在高鹽與低pH條件下將DNA吸附于硅層表面,然后在溫和的條件下將目標(biāo)DNA洗脫下來。但是在這種情況下,除了操作步驟繁瑣和操作時間較長之外,既會造成DNA的損耗,又會導(dǎo)致最終DNA溶液體系放大,無法實現(xiàn)濃縮和富集。于是,本研究期望有一種磁性納米粒子可以直接分離到微量的致病菌基因組DNA,并且可以將得到的微量磁性分離物(磁性納米粒子與DNA復(fù)合物)直接添加到PCR中進(jìn)行檢測,以達(dá)到快速且靈敏地檢測致病菌的目的。此前,我們發(fā)現(xiàn),氨基化磁性納米粒子具有這種能力,可以在溫和的條件下吸附大量的DNA,經(jīng)過封閉之后可以直接加入到PCR體系中而不影響PCR擴(kuò)增[6]。本研究對氨基化磁性納米粒子氨基化修飾的方法進(jìn)一步優(yōu)化以提高分離效率,之后用這種方法分離了牛奶中的金黃色葡萄球菌基因組DNA,再結(jié)合PCR技術(shù),從而實現(xiàn)了快速靈敏的分子檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、環(huán)己烷、正己醇、氨水等常見化學(xué)試劑 分析純，上海國藥集團(tuán);正硅酸四乙酯(TEOS)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、對硝基苯甲醛、溶菌酶、蛋白酶K Sigma-Aldrich公司;TaqDNA聚合酶及其他配套PCR試劑 Thermo-Fisher公司;金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 13565 為本實驗室保存菌株。金黃色葡萄球菌特異性檢測引物(nuc-f:ATCA TTATTGTAGGTGTATTAGC,nuc-r:CAGGCGTATTC GGTTTC[7]) 由上海生物工程股份有限公司進(jìn)行合成。培養(yǎng)金黃色葡萄球菌所用培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基,BD公司生產(chǎn)。

Eppendorf 5415D微量臺式離心機(jī)離心機(jī)、5804R臺式高速冷凍離心機(jī)、Eppendorf AG PCR儀 德國Eppendorf公司;透射電鏡(TEM)H-600 日本日立公司;超聲波清洗儀 昆山超聲儀器有限公司。

1.2 氨基化硅包磁性納米粒子的制備

硅包磁性納米粒子制備參考文獻(xiàn)步驟[8],先用共沉淀法制備Fe3O4磁性納米粒子,然后在反相微乳液中水解TEOS進(jìn)行包硅,產(chǎn)物用APTES進(jìn)行氨基化修飾。最終得到的硅包磁性納米粒子真空干燥后確保無水,分散于三種溶劑(50 mL甲苯、50 mL水、50 mL水∶無水乙醇(1∶4,v/v)溶液)中,超聲輔助確保徹底分散,加入2 mL的APTES,持續(xù)通氮氣,80 ℃回流12 h。用乙醇和水反復(fù)洗滌,最終真空干燥。

1.3 分光光度法測定納米粒子表面氨基數(shù)量

以對硝基苯甲醛為偶聯(lián)試劑,利用分光光度法測定納米粒子表面的氨基數(shù)目[9],具體步驟如下:5 mg氨基化硅包磁性納米粒子用偶聯(lián)溶液(1.6 mL冰乙酸添加到無水甲醇中,用無水甲醇定容至200 mL),反復(fù)洗滌。磁性分離,在剩余磁性固形物中加入1%的對硝基苯甲醛溶液(溶劑為偶聯(lián)溶液),混合3 h之后用偶聯(lián)溶液多次磁性洗滌,除去游離的對硝基苯甲醛,加入1 mL水解溶液(0.4 mL冰乙酸添加到50%的甲醇溶液中,甲醇溶液定容至300 mL),混合1 h后用磁鐵將磁珠分離于離心管底部,吸取900 μL上層清液,14000 r/min離心10 min,確保上層清液中沒有磁性粒子,吸取上層清液800 μL,測定267 nm處吸光值。同時用梯度稀釋的對硝基苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定不同樣品中的氨基含量。

1.4 氨基化硅包磁性納米粒子從PCR緩沖溶液中分離DNA性能比較

分別取不同的氨基化硅包磁性納米粒子配制成1 mg/mL的工作液,取50 μg加入到1 mL金黃色葡萄球菌基因組DNA中(溶劑為1×PCR緩沖液),90 ℃混合10 min,然后磁性分離納米粒子,分別取分離后與未分離的對照液2 μL作為模板進(jìn)行qPCR測定,通過計算溶液中減少的DNA量間接比較磁性納米粒子對DNA的吸附能力。

1.5 人工污染金黃色葡萄球菌的牛奶中基因組DNA的提取方法

取金黃色葡萄球菌過夜培養(yǎng),用蛋白胨水依次10倍稀釋,將不同梯度的金黃色葡萄球菌人工污染牛奶,分別取不同污染量的牛奶10 mL,4 ℃下以轉(zhuǎn)速12000 r/min離心20 min,棄去上層清液以及脂肪層,將收集到的固體沉淀物用0.5 mL含有0.5%曲拉通100的TE緩沖溶液(pH9.0)分散,然后加入50 μL的50 g/L溶菌酶與50 μL的20 g/L蛋白酶K處理30 min。水煮10 min,迅速冷卻。用比例為25∶24∶1的苯酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提,所得水層移到一個新的1.5 mL離心管中。加入50 μg磁珠,在90 ℃下混合10 min。外加磁場收集磁性物體,以此作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。

1.6 qPCR與普通PCR

qPCR體系(25 μL)包含12.5 μL的2×SYBR Green qPCR Mix、10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL。PCR熱循環(huán)步驟:95 ℃保持2 min,每個循環(huán)溫度為95、60、72 ℃下分別保持10 s,共40個循環(huán)。

PCR擴(kuò)增體系(25 μL)包含1 U聚合酶、濃度為2.5 mmol/L的dNTP1 μL、10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL。PCR熱循環(huán)步驟:94 ℃保持5 min,每個循環(huán)溫度為94、60、72 ℃下分別保持30 s,共35個循環(huán),最后72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,EB染色觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基化磁性納米粒子表面氨基修飾數(shù)量的優(yōu)化

圖2 APTES結(jié)合在納米粒子表面示意圖Fig.2 The schematic diagram of binding between APTES and silica shell注:(a)為無水條件下,(b)為有水條件下。

先合成硅包磁性納米粒子,再通過水解APTES在其表面修飾氨基。在之前的文獻(xiàn)中[10-12],很多研究者用甲苯、水、水與乙醇混合物等試劑作為溶劑進(jìn)行反應(yīng),但是哪種方法制備的納米粒子表面攜帶更多的氨基并不知曉。本研究分別用甲苯、水、水與乙醇的混合物(體積比1∶4)作為溶劑,將APTES修飾于硅包磁性納米粒子表面,然后對比各產(chǎn)物表面氨基的數(shù)量。本研究中采用對硝基苯甲醛分光光度法測定納米粒子表面的氨基。對硝基苯甲醛在無水條件下與納米粒子表面的氨基結(jié)合,而在有水條件下會解離下來,通過測定洗脫液中對硝基苯甲醛的量間接獲得納米粒子表面的氨基數(shù)目。為了更全面地了解氨基修飾的情況,同時做了在三種溶劑中室溫和80 ℃兩種不同溫度的對比。在測得267 nm處吸光值之后,將數(shù)值代入由不同濃度對硝基苯甲醛制備得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=9.3913x+0.0134,R2=0.998)。最后的結(jié)果如圖1所示,與之前報道的用水做溶劑具有較好的氨基修飾效率[13]不同,用甲苯作為溶劑具有更高的氨基修飾率。此外,同樣是升高溫度,以甲苯為溶劑,升高溫度可以增加氨基修飾效率,而以水或水與乙醇混合物為溶劑會降低氨基修飾效率。

圖1 不同溶劑制備所得ASMNPs表面攜帶的氨基數(shù)量Fig.1 The amount of amino groups of nanoparticles modified in different solvent 注:水:乙醇混合物體積比為1∶4。

根據(jù)文獻(xiàn)的報道[13-15],APTES連接到硅表面可以通過兩種方式:一種是在無水條件下,APTES與硅表面的羥基直接縮合(圖2a);其二,在有水條件下,APTES先水解,然后形成的羥基與硅表面的羥基互相縮合(圖2b)。但是,在有水條件下,APTES的水解產(chǎn)物也可以相互縮合交聯(lián)。之所以得到以上的不同結(jié)果,原因可能是:在有水條件下,高溫促進(jìn)了APTES水解產(chǎn)物之間的縮合,而縮合產(chǎn)物和硅層上的羥基并不容易發(fā)生結(jié)合;在無水條件下,APTES只能與硅表面的羥基縮合,自身之間無法縮合,高溫促進(jìn)了與硅表面羥基的結(jié)合。因此,在有水條件下,氨基修飾的數(shù)目隨溫度升高反而降低,在無水條件下隨溫度升高而增加。根據(jù)實驗結(jié)果來看,用甲苯作為溶劑具有明顯的優(yōu)勢。

2.2 表面攜帶不同氨基數(shù)量的納米粒子對DNA捕獲性能的比較分析

根據(jù)本課題組之前的研究[6],納米粒子可能是通過氫鍵作用及靜電作用與DNA結(jié)合,氨基在其中充當(dāng)重要角色,將兩種不同氨基攜帶率的氨基化磁性納米粒子(MS1:以甲苯為溶劑反應(yīng)溫度為80 ℃條件下得到的氨基化磁性納米粒子;MS2:以水為溶劑反應(yīng)溫度為80 ℃條件下得到的氨基化磁性納米粒子)捕獲金黃色葡萄球菌基因組DNA的能力進(jìn)行比較。結(jié)果如圖3所示,氨基攜帶率越高的磁性納米粒子組別Ct值越低,即表面氨基越多,納米粒子捕獲DNA的能力越強(qiáng)。將Ct值代入由不同已知濃度的金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=-3.458x+33.21,R2=0.9995)中進(jìn)行計算,MS1與MS2對同樣的溶液DNA分離效率分別為97.4%和76.9%。因此,選用以甲苯為溶劑80 ℃下反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)的實驗。

圖3 不同氨基攜帶率的納米粒子對基因組DNA的吸附能力Fig.3 The DNA adsorption of nanoparticles with different amounts of amino groups

2.3 在人工污染金黃色葡萄球菌牛奶中的應(yīng)用

將金黃色葡萄球菌過夜培養(yǎng),并用蛋白胨水稀釋成不同的濃度,對購買的牛奶(經(jīng)過培養(yǎng)法檢測不含有金黃色葡萄球菌)進(jìn)行人工污染,得到不同濃度人工污染金黃色葡萄球菌的牛奶樣品,然后按照1.6的方法進(jìn)行處理,最終用磁性分離得到的吸附有DNA的磁性納米粒子作為模板進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,EB染色之后進(jìn)行觀察并拍照。結(jié)果如圖4所示,當(dāng)牛奶中金黃色葡萄球菌最低濃度為100 CFU/mL時可以檢測到。也就是說,氨基化硅包磁性納米粒子分離牛奶處理物中致病菌基因組DNA,然后結(jié)合普通PCR檢測,對于金黃色葡萄球菌檢出限為100 CFU/mL。

圖4 人工污染金黃色葡萄球菌牛奶的檢測靈敏度Fig.4 The sensitivity of this method for detection of Staphylococcus aureus in milk注:NC:陰性對照。

2.4 與其他檢測方法的結(jié)果對比

如表1所示,為了證明磁性分離在本檢測(方法1)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用,同時對人工污染的牛奶用其他兩種DNA提取方法進(jìn)行提取,然后結(jié)合PCR進(jìn)行檢測。這兩種方法分別為CTAB法[1](方法2)和試劑盒法(方法3,所用試劑盒為Sangon EZ-10 Spin Column Bacterial Genomic DNA Isolation Kit),這兩種方法均無法檢出含有105CFU/mL人工污染金黃色葡萄球菌的牛奶樣品為陽性。用CTAB法進(jìn)行提取時,雖然增加了抽提步驟,但是最終得到的DNA提純物中還是含有大量的不明沉淀物,這些沉淀物的產(chǎn)生可能是因為牛奶中含有大量的蛋白質(zhì)等雜質(zhì),而且多次抽提還會增加DNA的損耗,所以無法檢測可能是因為抑制物和損耗兩方面的原因。同樣地,試劑盒法也可能因為牛奶樣品中大量的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)導(dǎo)致DNA純化效果不好,導(dǎo)致即使在較高的人工污染濃度下也無法檢測到。

表1 幾種檢測方法靈敏度對比Table 1 The comparison on sensitivities of different detection methods

注:方法1:本方法,即磁性分離DNA結(jié)合PCR檢測;方法2:CTAB法提取DNA結(jié)合PCR檢測;方法3:試劑盒提取DNA結(jié)合PCR檢測,+:有目標(biāo)條帶;-:沒有目標(biāo)條帶。

用分子生物學(xué)的技術(shù)檢測食品中致病菌時,很多時候無法做到靈敏的檢測,這是因為檢測物中含有大量的PCR抑制物,而致病菌在其中的比例非常有限。一般常規(guī)的方法無法做到從如此復(fù)雜的物質(zhì)中分離得到微量的致病菌DNA。普通的DNA提取方法主要是針對純培養(yǎng)物,成分相對簡單,只需要簡單的離心就可以達(dá)到較好的富集和除雜作用,但是對于復(fù)雜介質(zhì)中的微量提取就顯得力不從心。磁性分離的優(yōu)勢在這里得以充分展現(xiàn),一方面,最大程度地去除食品中的PCR抑制物;另一方面,可以將微量的目標(biāo)物進(jìn)行有效的分離與濃縮。本研究是用氨基化磁性納米粒子分離牛奶處理物中的致病菌基因組DNA,這種方法沒有特異性,可以應(yīng)用于任意一種致病菌檢測,而且結(jié)合多重PCR可以同時檢測多種致病菌。這個優(yōu)勢是免疫磁珠無法實現(xiàn)的,一種免疫磁珠只能針對一種特定的致病菌,而且當(dāng)檢測多種致病菌時必須要用到多種抗致病菌抗體。

雖然我們之前發(fā)現(xiàn)氨基化硅包磁性納米粒子直接加入到PCR體系中會對PCR產(chǎn)生抑制[7],這種抑制作用是因為氨基化硅包磁性納米粒子通過表面吸附了一些PCR成分,但是,我們也發(fā)現(xiàn)在磁性捕獲DNA之后用類似脫脂奶粉的封閉溶液進(jìn)行封閉之后再添加進(jìn)PCR就不會造成明顯抑制作用。在本研究中,即使磁性分離后不封閉也不會造成明顯抑制,這是因為雖然牛奶經(jīng)過了多步處理,一些蛋白質(zhì)類物質(zhì)依然殘留,這些殘留物足以將磁性納米粒子表面進(jìn)行封閉。

3 結(jié)論

用不同的方法在硅包磁性納米粒子表面修飾氨基基團(tuán),經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)用甲苯作為溶劑所制備的氨基化磁性納米粒子表面攜帶有更多的氨基。用不同氨基攜帶量的磁性納米粒子分離純化后的金黃色葡萄球菌基因組DNA,結(jié)果顯示,氨基攜帶量與DNA分離率相關(guān)。將人工污染金黃色葡萄球菌的牛奶樣品經(jīng)過簡單處理,然后磁性分離其中的基因組DNA,將磁性納米粒子與DNA復(fù)合物直接加入PCR體系進(jìn)行檢測,靈敏度可以達(dá)到100 CFU/mL水平。總的來說,這種方法在檢測食品中致病菌污染時有著顯著的優(yōu)勢,而且還可以用于病毒檢測以及轉(zhuǎn)基因檢測等所有涉及到核酸檢測的領(lǐng)域。

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Development of a rapid detection method forStaphylococcusaureusin milk based on magnetic separation using amino modified silica coated magnetic nanoparticles and polymerase chain reaction

CUI Yan,BAI Ya-long,SHI Chun-lei,WANG Da-peng,SHI Xian-ming*

(MOST-USDA Joint Research Center for Food Safety,School of Agriculture and Biology, and State Key Laboratory of Microbial Metabolism,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China)

In this study,the synthesis of amino-modified silica-coated magnetic nanoparticles were optimized,the optimal nanoparticles were used to adsorb a trace amount of genetic DNA fromStaphylococcusaureusin milk,and then the complexes were used as DNA templates to be added into PCR. The limit of detection could reach 100 CFU/mL. The DNA and nanoparticle were directly added to PCR system during this process,without any steps of elution and purification. The cost of this magnetic separation method was quite low,for there was no need for nanoparticles to be labelled with biologic molecules such as antibody. This method has a great potential in the rapid detection of living organism.

amino-modified silica-coated magnetic nanoparticles;Staphylococcusaureus;PCR;DNA;magnetic separation

2016-10-21

崔妍(1986-)，女，碩士，實驗師，研究方向：食品安全與食品生物技術(shù)，E-mail：cyan9028@163.com。

*通訊作者:史賢明(1961-)，男，博士，教授，研究方向：食品安全與食品生物技術(shù)，E-mail：xmshi@sjtu.edu.cn。

國家重點研發(fā)計劃課題(2016YFD0401102)；上海交通大學(xué)“Agri-X”基金(AgriX2015005)。

TS207.4

A

1002-0306(2017)07-0295-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.049