石菖蒲中高純度β細辛醚和α細辛醚的制備

裘紀瑩,趙雙枝,趙玉忠,陳蕾蕾,王同燕,王未名,*

(1.山東省農業科學院農產品研究所/山東省農產品精深加工技術重點實驗室,山東濟南 250100; 2.山東省醫學科學院,山東濟南 250062)

裘紀瑩1,趙雙枝1,趙玉忠2,陳蕾蕾1,王同燕1,王未名1,*

(1.山東省農業科學院農產品研究所/山東省農產品精深加工技術重點實驗室,山東濟南 250100; 2.山東省醫學科學院,山東濟南 250062)

建立了采用高壓半制備液相色譜制備石菖蒲中β-細辛醚和α-細辛醚高純單體化合物的方法。首先以石菖蒲為原料制備石菖蒲揮發油,然后采用高壓半制備液相色譜,設定流動相為甲醇∶水=65∶35(v/v),對β-細辛醚和α-細辛醚進行精制純化。產物的結構采用EI-MS、1H-NMR 和13C-NMR進行鑒定,而且它們的純度分別達到99.43%和99.08%。該方法操作簡單、制備量大、產物純度高,可用于石菖蒲中高純度β-細辛醚和α-細辛醚對照品的制備。

石菖蒲,高壓半制備液相色譜法,β-細辛醚,α-細辛醚,純化

石菖蒲為天南星科多年生草本植物石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)的干燥根莖,具有豁痰開竅、化濕和胃、醒神益智、芳香寧神的功效[1]。近代藥理學研究表明石菖蒲的有效成分——揮發油對中樞神經、心血管、呼吸和消化等多種系統具有調節作用[2],其主要有效成分為β-細辛醚和α-細辛醚(圖1)[3]。同時研究表明,β-細辛醚和α-細辛醚在抗腫瘤、治療中樞神經系統疾病及抗炎方面均具有良好的藥效[4-7]。可見,制備β-細辛醚和α-細辛醚高純單體化合物對于石菖蒲藥材的質量控制、成藥的生產工藝優化和質量控制以及β-細辛醚和α-細辛醚的藥理學研究等都非常重要。

高壓半制備/制備液相色譜技術是目前發展迅速的一種快速分離純化技術,該技術在分析型高效液相色譜技術的基礎上發展而來,具有上樣量大、分離度和靈敏度高、分離速度快和目標化合物純度高等特點,是目前半制備/制備高純度單體化合物的優選手段[8]。如王智聰等[9]采用高壓制備液相色譜法制備沒食子兒茶素沒食子酸酯高純單體化合物,結果顯示該方法操作簡單、制備量大、收率高、產物純度高,可用于沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)標準物質的研制。丁雯靜等[10]采用快速制備液相色譜從庫拉索蘆薈中高效分離制備了10-羥基蘆薈大黃素苷A和B,結果顯示該方法簡便、快速,所得產物純度較高,可用于對照品的制備和藥理毒理活性研究。本文以石菖蒲為原料制備其揮發油,并采用高壓半制備液相色譜法對其進行精制純化和結構鑒定,最后得到高純度的β-細辛醚和α-細辛醚,以期為采用高壓制備液相色譜法制備石菖蒲中的β-細辛醚和α-細辛醚標準物質提供參考。

圖1 α-細辛醚和β-細辛醚的化學結構式Fig. 1 The structures of α-asarone and β-asarone

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石菖蒲藥材 濟南建聯中藥店;甲醇 色譜級,山東禹王試劑有限公司;乙醇、石油醚等 均為分析純,天津市廣成化學試劑廠。

安捷倫1200分析型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;島津LC-6A高壓半制備液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 石菖蒲揮發油的制備 制備方法參照文獻[2],具體為:稱取一定量的石菖蒲藥材,采用50%乙醇回流提取3次,合并提取液,提取液濃縮至無醇味,過濾,將沉淀部分減壓干燥后用石油醚回流提取3次,合并石油醚提取液,回收溶劑至干,既得石菖蒲揮發油提取物。

1.2.2 高壓半制備液相色譜分離 將上述提取物用100%甲醇溶解,通過0.45 μm微孔濾膜過濾后進樣量200 μL,根據色譜圖接收餾分,對所得餾分采用HPLC面積歸一法[11]進行純度檢測,采用EI-MS、1H-NMR和13C-NMR進行結構鑒定。

1.2.3 液相色譜條件 分析采用1200型高效液相色譜儀,配置G1311A型四元梯度泵,G1329A型自動控溫進樣器,G1314B型可變波長檢測器,G1316A型柱溫箱,Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為甲醇-水(70∶30,v/v),流速1.0 mL/min,進樣量10 μL。制備采用島津LC-6A高壓半制備液相色譜儀,配置YMC色譜柱(20 mm×250 mm,5 μm),流動相為甲醇-水(65∶35,v/v),流速10.0 mL/min。檢測波長均為254 nm。

2 結果與分析

2.1 石菖蒲有效部位的高壓半制備液相色譜分離結果

本實驗采用不同洗脫條件、不同進樣體積對α-細辛醚和β-細辛醚進行分離,結果發現,采用甲醇-水體系作為流動相,甲醇的比例越高,α-細辛醚和β-細辛醚的保留時間越短,可縮短兩種產物的制備周期,但兩者的分離度下降,從而使產物純度下降。降低甲醇比例可提高兩者的分離度,但同時延長了產物的制備周期,使制備成本上升。在采用半制備液相色譜進行分離純化時,進樣體積同樣影響分離效果,過大的進樣量使產物峰產生平頭峰,從而使保留時間延后,影響分離度,而過小的進樣量又達不到制備的目的。通過多次實驗表明,當流動相條件為甲醇-水(65∶35,v/v),流速10.0 mL/min時,洗脫時間合適,同時當進樣量為200 μL,可實現兩個峰的較好分離,最終制備得到β-細辛醚(峰1)和α-細辛醚(峰2),純度分別為99.43%和99.08%,半制備液相色譜圖和制備產物液相色譜圖分別見圖2、圖3。

圖2 石菖蒲揮發油提取液的高壓半制備液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of semi-preparative HPLC of volatile oil extract of Acorus tatarinowii Schott注:峰1:β-細辛醚,峰2:α-細辛醚。

2.2 結構鑒定結果

化合物1(圖2-峰1):EI-MS:m/z 208[M]+,193[M-CH3]+,165[M-CH3CO]+,162.1[M-CH3HOCH2]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:1.86(3H,dd,J=1.5,7.5 Hz,H-3′),3.82,3.86,3.91(each,3H,s,OCH3),5.77(1H,dq,J=7.2,11.4,H-2′),6.46(1H,dq,br d,H-1′),6.55(1H,s,H-3),6.88(1H,s,H-6)。13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:14.7(C-3′),56.1(OCH3),56.4(OCH3),56.6(OCH3),97.5(C-3),114.1(C-6),118.0(C-5),124.8(C-2′),125.8(C-1′),142.4(C-1),148.5(C-2),151.5(C-4)。通過與文獻[12]比較,化合物1被鑒定為β-細辛醚(β-asarone)。

化合物2(圖2-峰2):EI-MS:m/z 208[M]+,193[M-CH3]+,165[M-CH3CO]+,162[M-CH3HOCH2]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:1.87(3H,dd,J=1.2,7.2 Hz,H-3′),3.81,3.85,3.88(each,3H,s,OCH3),6.12(1H,dq,J=6.6,15.6,H-2′),6.67(1H,dq,br d,H-1′),6.50(1H,s,H-3),6.96(1H,s,

圖3 石菖蒲揮發油及純化物的液相色譜圖Fig. 3 HPLC chromatograms of the volatile oil extract of Acorus tatarinowii Schott and the purified products注:A:石菖蒲揮發油提取物,B:β-細辛醚,C:α-細辛醚。

H-6)。13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:18.8(C-3′),56.1(OCH3),56.5(OCH3),56.7(OCH3),97.9(C-3),109.7(C-6),119.0(C-5),124.3(C-2′),125.0(C-1′),143.3(C-1),148.7(C-2),150.6(C-4)。通過與文獻[13]比較,化合物2被鑒定為α-細辛醚(α-asarone)。

3 結論

本文首次采用高壓半制備液相色譜法對石菖蒲藥材的主要有效成分β-細辛醚和α-細辛醚進行一步式分離純化,該方法操作簡單、制備量大、產物純度高,可用于石菖蒲中高純度β-細辛醚和α-細辛醚對照品的制備。

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Preparation of high purityβ-asarone andα-asarone fromAcorustatarinowiiSchott

QIU Ji-ying1,ZHAO Shuang-zhi1,ZHAO Yu-zhong2,CHEN Lei-lei1,WANG Tong-yan1,WANG Wei-ming1,*

(1.Institute of Agro-Food Science and Technology & Shandong Provincial Key Laboratory of Agro-Products Processing Technology,Shandong Academy of Agricultural Sciences,Jinan 250100,China; 2.Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062,China)

To establish a method for preparation of high purityβ-asarone andα-asarone fromAcorustatarinowiiSchott by high pressure semi-preparative liquid chromatography,its volatile oil was prepared fromAcorustatarinowiiSchott,and a semi-preparative high performance liquid chromatography was used to refine and purifyβ-asarone andα-asarone with a solvent composed of methanol and water(65∶35,v/v). The structures of product were identified by EI-MS,1H-NMR and13C-NMR,and their purities reached 99.43% and 99.08%,respectively. The method is easily operated,with high purity and preparation amount. It is suitable for high purityβ-asarone andα-asarone reference material preparation fromAcorustatarinowiiSchott.

AcorustatarinowiiSchott;high pressure semi-preparative liquid chromatography;β-asarone;α-asarone;purification

2016-12-27

裘紀瑩(1981-)，女，碩士，助理研究員，主要從事農產品加工方面的研究，E-mail：qjyfood@163.com。

*通訊作者:王未名(1957-)，男，學士，研究員，主要從事農產品加工方面的研究，E-mail：wweiming@163.com。

山東省自然科學基金三院聯合基金項目(ZR2014YL020)；山東省農業科學院青年科研基金項目(2014QNM47)；泰山學者建設工程專項。

TS201.1

A

1002-0306(2017)07-0293-03

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.048