響應面法優化木瓜蛋白酶提取紅稗多糖工藝

蘇 偉,宋 玉,母應春,李澤秀,黎以欒

(貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州貴陽 550025)

響應面法優化木瓜蛋白酶提取紅稗多糖工藝

蘇 偉,宋 玉,母應春,李澤秀,黎以欒

(貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州貴陽 550025)

在單因素實驗基礎上應用響應面法對木瓜蛋白酶提取紅稗多糖工藝進行優化。優化的木瓜蛋白酶提取紅稗多糖的最佳工藝條件如下:加酶量0.3%、酶作用時間1.0 h、酶作用pH6.5、酶作用溫度50 ℃,在此條件下,多糖得率為28.47%。優化的木瓜蛋白酶法提取紅稗多糖工藝合理、可行。

木瓜蛋白酶,紅稗多糖,工藝優化

紅稗(Bacca sedge)是一種表皮為紅褐色的粒子,也叫野紅米草、紅米和芭茅草等,最初記載于《滇南本草》,屬于莎草科苔屬植物[1]。紅稗是貴州,四川,云南等西南地區的一種特色雜糧,是云南民間一種習用藥。在很早以前,民間就將紅稗當成食物食用,但因其產量低,且不是主要糧食,所以對其研究較少。紅稗營養價值豐富,主要含有粗蛋白質5.20%,總糖76.73%,粗纖維2.57%,水分10.15%,粗脂肪2.66%,灰分2.21%,紅稗所含的必需氨基酸組成比例和人體需求相近,與FAO/WHO推薦模式較為符合[2],所以,紅稗將來很有可能成為一種較好的功能性食品原料。目前,研究發現多糖及其復合物,可參與和介導細胞的各種生命現象調節,具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調節、降血糖、抗病毒、降血脂等生物活性[3]。

李澤秀[4]等對紅稗多糖超聲提取工藝進行了系統的研究,但其使用的是sevage法(三氯甲烷∶正丁醇=5∶2)來除掉蛋白,這種方法不僅耗時,而且提取率也比較低(僅23.82%)。因此,優化紅稗中多糖的提取工藝對紅稗多糖的開發利用具有一定意義。目前,最常用于多糖提取的方法主要有水提醇沉法[5-7]、超聲輔助提取法[8-11]以及微波輔助提取法[12-16]、酶提法[17-22]等。本實驗采用響應面法優化木瓜蛋白酶法提取紅稗多糖工藝,簡化了除蛋白的過程,為以后開發和利用紅稗多糖提供理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅稗 由貴州省遵義市君惠園食品有限公司提供;木瓜蛋白酶(酶活性80萬U/g) 購自廣西龐博生物工程有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

FW135粉碎機、DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;101型電熱鼓風干燥箱 北京市光明醫藥儀器廠;BS124S電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;HN88-Hl超聲波細胞粉碎機 上海汗諾儀器有限公司;TDl8M臺式低速冷凍離心機 長沙湘儀器儀表有限公司;T6新世紀紫外分光光度計 北京市普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制 提取液中的多糖含量測定采用苯酚硫酸法[23],稱105 ℃干燥至質量恒定的葡萄糖50 mg,用超純水溶解并定容至50 mL,精確量取2.5 mL葡萄糖溶液用超純水定容至50 mL的容量瓶中,配制成葡萄糖標準溶液,精確量取配制好的葡萄糖標準溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別置于干燥帶塞的試管中,加超純水到1.0 mL,依次加入1.0 mL的5%苯酚溶液,搖勻,再依次滴加5.0 mL的濃硫酸,搖勻,蓋好玻璃塞于室溫下靜置30 min,于490 nm下,調空白對照組的吸光度為零,測定其吸光度。以吸光度(A)為縱坐標、葡萄糖濃度(C)為橫坐標繪制葡萄糖的標準曲線圖,其回歸方程為:Y=0.0036x-0.0036(R2=0.9987)。

1.2.2 紅稗多糖提取工藝流程 紅稗→除雜→粉碎→過篩→烘干→乙醇浸泡脫色→烘干→甲醇回流脫脂→烘干→磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液超聲波破碎提取→加酶→水浴提取→離心取上清液→加苯酚和濃硫酸→紫外分光光度計測吸光值→乙醇沉淀→乙醇、丙酮洗滌→真空冷凍干燥→紅稗粗多糖[24]。

1.2.3 多糖的提取與含量測定 新鮮紅稗清洗,除雜,粉粹,過120目篩,烘干,用乙醇溶劑脫色3次,每次15 min,再用甲醇在冷凝管中回流脫脂,在80 ℃的水浴鍋中加熱6 h,烘干,稱取1.0 g的紅稗粉于燒杯中,加入20倍體積的pH4.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液,用超聲破碎提取15 min,加木瓜蛋白酶水解,然后4000 r/min離心10 min,取上清液1 mL,用苯酚-硫酸法測定多糖含量,按式(1)計算紅稗多糖的得率。

式(1)

式中:Y為紅稗多糖的得率(%);C為多糖的質量濃度(μg/g);F為樣品稀釋倍數;V為加入反應液的總體積(mL);m為樣品準確稱取的質量(g)。

1.2.4 單因素實驗 選取加酶量,酶作用時間,酶作用pH和酶作用溫度四個因素,每個因素設置3個水平,每個水平重復三次:準確稱取脫脂過的紅稗粉1.0 g左右,加入20倍體積的pH4.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液[25],超聲15 min,冷卻至室溫,依次加入相當于紅稗粉質量比0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的木瓜蛋白酶,于50 ℃的水浴鍋中提取60 min,離心(10 min,4000 r/min),取上清液,使用苯酚-硫酸比色法檢測多糖含量,考察不同加酶量對多糖得率的影響;固定加酶量為0.3%,酶作用pH為4.5,酶解溫度為50 ℃,其余步驟同上,比較不同酶作用時間(30、45、60、75、90 min)對紅稗多糖提取得率的影響;控制加酶量為0.3%,酶作用溫度為50 ℃,酶作用時間為60 min,通過加入20倍體積的pH為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液,比較不同酶解pH對紅稗多糖得率的影響;控制加酶量為0.3%,酶作用時間為60 min,酶作用pH為6.5,比較不同酶解溫度(20、30、40、50、60 ℃)對紅稗多糖得率的影響。按照公式(1)計算多糖的得率。

1.2.5 優化實驗 響應面法對紅稗多糖提取條件優化,根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理,選取4因素(加酶量,酶作用pH,酶作用時間,酶作用溫度)3水平對紅稗多糖提取條件進行優化,實驗因子和水平見表1。

表1 Box-Behnken設計因素水平表Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken

1.2.6 數據處理 實驗數據采用Origin 9.0軟件作圖,Design-Expert 8.0.6軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 木瓜蛋白酶加酶量對紅稗多糖得率的影響 由圖1可知,在加酶量低于0.3%時，隨著木瓜蛋白酶加酶量的增大,紅稗多糖得率逐漸增大,當加酶量超過0.3%以后,多糖得率趨于平緩。說明酶用量在0.3%之前,底物和酶沒有充分的結合,而在0.3%的酶濃度時,底物和酶已經完全結合,多糖已經完全釋放,當再增大酶用量時,增加的酶分子也沒有機會與底物結合,多糖得率就很難以有顯著增加。因此,選擇木瓜蛋白酶加酶量為0.3%。

圖1 不同加酶量對紅稗多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzyme amount on the extraction yield of polysaccharide of Baccage sedge

圖2 不同酶作用時間對紅稗多糖得率的影響Fig. 2 Effect of different enzymolysis time on the extraction yield of polysaccharide of Baccage sedge

2.1.2 木瓜蛋白酶作用時間對紅稗多糖得率的影響 由圖2可知,在60 min之前隨著酶解時間的延長,紅稗多糖得率呈上升趨向,在60 min時到達極值,而后隨著酶解時間的延長,紅稗多糖得率反而呈下降趨勢,這估計是由于有些糖苷鍵因提取時間過長而在蛋白酶的催化作用下被裂解了,或者是提取時間太久使得多糖的結構發生了變化。因此選擇酶作用時間為60 min。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.1.3 木瓜蛋白酶酶解pH對多糖得率的影響 由圖3可知,在pH6.5之前隨著pH的增大,紅稗多糖的得率逐漸增加,當增加到pH6.5時,紅稗多糖的得率達到極值,隨后再繼續增大pH,紅稗多糖得率反而呈下降趨勢。因為木瓜蛋白酶的最適pH在6.5左右,pH除了對酶活性有很大影響外,對酶的穩定性也有很大影響。過高過低的pH會改變酶的活性中心的構象,甚至改變整個酶分子的結構使其變性失活,從而影響紅稗多糖的得率。因此最佳pH選擇6.5。

圖3 不同酶作用pH對紅稗多糖得率的影響Fig.3 Effect of different pH value on the extraction yield of polysaccharide of Baccage sedge

2.1.4 木瓜蛋白酶作用溫度對紅稗多糖得率的影響 由圖4可得知,在50 ℃之前隨著酶作用溫度的升高,紅稗多糖得率逐漸增大,于50 ℃時多糖得率達到最大值,而當溫度大于50 ℃后多糖得率出現下降的趨勢,出現以上的現象是因為溫度對酶促反應和細胞擴散反應具有雙重影響,木瓜蛋白酶的最適作用溫度為50 ℃左右,當溫度過高會使酶活力降低甚至失去活性,使得多糖得率下降。因此,最佳溫度選擇50 ℃。

圖4 不同酶作用溫度對紅稗多糖得率的影響Fig.4 Effect of different enzymolysis temperature on the extraction yield of polysaccharide of Baccage sedge

表3 響應面ANOVA分析結果Table 3 Response surface analysis results ANOVA

注:p<0.01,為差異極顯著,用“**”表示;p<0.05,為差異顯著,用“*”表示;p>0.05,為不顯著。

2.2 響應面實驗

2.2.1 木瓜蛋白酶對紅稗多糖提取工藝的響應面優化 以單因素實驗為基礎,采用Box-Behnken的中心原理進行實驗,以多糖得率(%)作為響應值。以加酶量(%),酶作用時間(h),酶作用pH,酶作用溫度(℃)四因素作為自變量,結果如表2所示。

用響應面分析軟件Design-Expert 8.0.6對表2的數據進行多元回歸擬合,實驗數據擬合分析(analysis of variance,ANOVA)結果見表3。

各個實驗因素對響應值(紅稗多糖得率)的影響,可以通過以下回歸擬合后與紅稗多糖得率(Y)的回歸方程表示:

Y=28.99+0.84A+0.71B-0.81C-0.90D-2.43AB+0.98AC-0.37AD-3.25BC+2.31BD+1.29CD-4.22A2-3.81B2-3.35C2-1.51D2

2.2.2 各因素對紅稗多糖得率交互影響的響應面圖 各圖顯示酶作用時間,酶作用溫度,加酶量,酶作用pH任意兩個因素之間的交互作用對紅稗多糖得率(Y)的影響,由響應面三維圖的最高點可以看出,在所選因素的范圍內有極值存在,這個值就是響應面的最高點。

使用Design Expert 8.0.6軟件對實驗數據進行處理,并繪制得出加酶量、酶作用時間、酶作用pH及酶作用溫度對響應值紅稗多糖得率的交互影響的曲面圖,各因素固定值為0水平值,結果如圖5所示。

圖5 各因素對紅稗多糖得率交互影響的響應面圖Fig.5 Response surface graphs showing the interactive effects of hydrolysis conditions on Baccage sedge

由圖5(a)、圖5(c)、圖5(d)、圖5(e)、圖5(f)得,等高線呈橢圓形,說明加酶量和酶作用時間、加酶量和酶作用溫度、酶作用時間和酶作用pH、酶作用時間和酶作用溫度、酶作用pH和酶作用溫度均存在交互作用。由圖5(b)可知,其等高線形狀接近圓形,說明加酶量和酶作用時間這兩因素交互作用不明顯。用軟件Design Expert 8.0.6 分析得到最優工藝參數為:加酶量0.31%,酶作用時間1.02 h,酶作用溫度50.39 ℃,酶作用pH6.35,紅稗多糖的得率為29.28%。

表4 最佳提取條件驗證實驗Table 4 Verification experiment of the optimal extraction conditions

2.2.3 驗證實驗 為了驗證響應面法的可行性,采用得到的最佳提取條件進行紅稗多糖浸提的驗證實驗,見表4,同時考慮到實際操作和生產條件等因素,修正工藝參數為:加酶量0.3%,酶作用時間1.0 h,酶作用溫度50 ℃,酶作用pH6.5,進行3次平行實驗得到的多糖實際得率28.47%,與預測值29.28%,相對誤差為0.81%。因此,響應面法優化木瓜蛋白酶對紅稗多糖提取條件是可行的,得到的紅稗多糖提取條件是具有實際應用價值的。

3 結論

木瓜蛋白酶是一種含巰基(—SH)肽鏈內切酶,具有蛋白酶和酯酶的活性[25],在紅稗多糖提取過程中可使紅稗中的游離蛋白質發生水解,并進一步水解蛋白等結合蛋白中的蛋白質,減少它們與紅稗多糖的結合力,有利于紅稗多糖的溶出,同時也提高了紅稗多糖的純度,簡化了紅稗多糖的提取工藝。

本實驗采用響應面法優化木瓜蛋白酶提取紅稗多糖工藝,通過F值得出,四個因素對紅稗多糖得率的影響順序從大到小依次為:酶作用的溫度>加酶量>酶作用的pH>酶作用的時間。經單因素和響應面實驗,得出木瓜蛋白酶提取紅稗多糖的最佳工藝為加酶量0.3%、酶作用pH6.5、酶作用時間1.0 h、酶作用溫度50 ℃,在此條件下得到的實際多糖得率為28.47%，與預測值的相對誤差僅為2.77%,表明Box-Benhnken設計法用于木瓜蛋白酶提取紅稗多糖工藝優化是可行的。李澤秀[4]等人采用超聲波輔助分離提取紅稗多糖,實驗結果得到實際多糖得率為23.82%,這表明木瓜蛋白酶輔助提取紅稗多糖優于超聲提取。

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Optimization of extraction of polysaccharides from Baccage Sedge using papain by response surface methodology

SU Wei,SONG Yu,MU Ying-chun,LI Ze-xiu,LI Yi-luan

(School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Based on the single factor experiments,the response surface methodology(RSM)was employed to optimize the extraction conditions of polysaccharides from Baccage sedge using papain. The results of optimum extraction conditions were as follow:enzyme amount 0.3%,enzyme time 1.0 h,pH6.5,temperature of 50 ℃. Under these conditions,the average extraction yield was 28.47%. The optimization of Baccage sedge extraction process technology was reasonable and feasible.

papain;Baccage sedge polysaccharide;extraction process

2016-10-19

蘇偉(1974-)，男，博士，副教授，研究方向：食品加工與安全，E-mail:suwei1886@163.com。

貴州省科技廳農業攻關項目(黔科合NY[2013]3052號)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0256-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.042