正交實驗法優化發酵蜈蚣粉中總黃酮提取工藝

王彥多,劉春雨,呂世潔,王 穎,王立娜,王集會

(1.山東中醫藥大學藥學院,山東濟南 250355; 2.山東中醫藥大學實驗中心,山東濟南 250355)

正交實驗法優化發酵蜈蚣粉中總黃酮提取工藝

王彥多1,劉春雨1,呂世潔1,王 穎1,王立娜1,王集會2，*

(1.山東中醫藥大學藥學院,山東濟南 250355; 2.山東中醫藥大學實驗中心,山東濟南 250355)

目的:采用正交實驗法優化發酵蜈蚣粉總黃酮回流提取工藝。方法:在對發酵蜈蚣粉中總黃酮提取條件進行單因素實驗的基礎上,以提取溫度(A)、料液比(B)和提取時間(C)為自變量,發酵蜈蚣粉總黃酮得率為因變量,利用正交實驗法探究最佳提取工藝條件。同時采用MTT體外抗腫瘤實驗方法,研究發酵蜈蚣粉提取物對肺腺癌A549細胞的抑制作用。結果:影響發酵蜈蚣粉總黃酮得率提取因素的大小次序為:料液比>提取溫度>提取時間,在此次實驗中,發酵蜈蚣粉最佳提取工藝為:提取溫度80 ℃,料液比1∶40 (g∶mL),提取時間2.5 h,在此條件下發酵蜈蚣粉中總黃酮得率為1.970%;提取獲得的不同濃度的發酵蜈蚣醇提液對肺腺癌A549細胞的抑制率均大于順鉑,具有較優良的抗腫瘤活性。

發酵蜈蚣粉,正交實驗,回流提取,總黃酮,MTT法,肺腺癌A549細胞株

蜈蚣為蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣(ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch)的干燥體。辛,溫;有毒[1]。作為傳統中藥材,具有息風止痙,解毒散結,通絡止痛的作用[2]。現在臨床常用于治療腫瘤、原發性高血壓、糖尿病及并發癥、神經性頭痛、偏頭痛等[3-4]。

黃酮類化合物具有抗炎、抗氧化壓力和抑制癌基因表達的作用[5]。而通過使用球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill)對蜈蚣進行發酵可以提高蜈蚣中黃酮類物質的含量,增強其解毒散結的功效,還可以較大幅度的改變藥性、提高療效、降低毒副作用[6]。由此本實驗采用水浴回流提取法、通過設計正交實驗優化發酵蜈蚣粉總黃酮的提取工藝,并對其進行體外抗腫瘤活性研究。為進一步開發利用該中藥提供理論依據。目前,對蜈蚣的研究大多聚焦于未發酵蜈蚣,而對發酵類蜈蚣黃酮提取及生物活性研究卻鮮有文獻報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆丁對照品 中國醫藥上海化學試劑公司生產;無水乙醇,亞硝酸鈉,六水氯化鋁,氫氧化鈉等試劑均為分析純;RPMI-1640培養基、胎牛血清 賽默飛世爾生物制品北京有限公司;胰酶 上海碧云天生物技術有限公司;注射用順鉑 齊魯制藥有限公司;MTT。

本實驗所使用的蜈蚣粉 安徽亳州市(批號:20150730),經山東中醫藥大學藥學院高德民副教授鑒定為少棘巨蜈蚣(ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch)。發酵蜈蚣粉(批號:20160301)由山東中醫藥大學化學實驗室自制。

肺腺癌A549細胞株 由山東省立醫院提供。

UV9100B型紫外可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司;ST 16R高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;SHB-III循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;FA1004N電子天平 上海精密科學儀器有限公司;SK-1快速混勻漩渦器 中國 深圳;遠紅外輻射干燥箱 上海陽光實驗儀器有限公司;梅特勒-托利多分析天平 上海先悅機電有限公司;Memmert 二氧化碳培養箱 北京五洲東方科技發展有限公司;EL340i型全自動酶標儀 Molecular Davices。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁對照品0.0200 g,用60%的乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中,靜置,得到2 mg/mL蘆丁標準溶液[7]。分別取此溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL,分別加入5個干燥的10 mL試管中,加入30%的乙醇至5 mL,再加入0.30 mL 5%的NaNO2溶液,搖勻,靜置6 min,加入0.60 mL 10%的AlCl3·6H2O溶液,搖勻,靜置5 min,然后加入2.00 mL 4%的NaOH溶液,最后加入30%乙醇定容至10 mL刻度,搖勻。在 510 nm處測定吸光度,以吸光度對濃度做標準曲線。

1.2.2 提取工藝流程 精密稱取發酵蜈蚣粉1.0000 g,按料液比加入80%乙醇,回流提取兩次,抽濾,取上清液于3000 r/min離心10 min,收集上清液于50 mL容量瓶中定容,置于4 ℃ 冰箱保存備用[8-9]。

1.2.3 單因素實驗 以溫度、料液比和提取時間三個因素為研究對象,以發酵蜈蚣粉總黃酮得率為指標進行單因素實驗。

1.2.3.1 提取溫度對總黃酮得率的影響 以發酵蜈蚣粉中總黃酮得率為指標,在固定料液比1∶25(g∶mL)、乙醇濃度80%、提取兩次的條件下,考察不同提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)對總黃酮得率的影響。

1.2.3.2 料液比對總黃酮得率的影響 以發酵蜈蚣粉中總黃酮得率為指標,在固定提取溫度70 ℃、回流提取時間1.5 h、乙醇濃度80%、提取兩次的條件下,考察不同料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g∶mL)對總黃酮得率的影響[10]。

1.2.3.3 提取時間對總黃酮得率的影響 以發酵蜈蚣粉中總黃酮得率為指標,在固定提取溫度70 ℃、料液比1∶25(g∶mL)、乙醇濃度80%、提取兩次的條件下,考察不同提取時間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)對總黃酮得率的影響。

1.2.4 工藝條件的優化 為了獲得以乙醇作為溶劑,回流提取發酵蜈蚣粉中總黃酮的最佳工藝條件,在單因素實驗的基礎上,以總黃酮得率為指標,設計三因素、三水平的正交實驗。

表1 因素水平編碼Table 1 Coded of factors and levels

1.2.5 發酵中藥蜈蚣中總黃酮得率的計算:

式中:A為吸光度,Y為發酵中藥蜈蚣總黃酮得率(%)。

1.2.6 抑瘤實驗方法 將處于對數生長期的肺腺癌A549細胞以每孔100 μL接種于96孔培養板,每孔培養前的細胞個數為8×104,預留三個調零孔,調零孔只加不含血清的1640培養基,不加細胞,在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。24 h后,細胞數增長至整個孔的90%左右,棄掉培養基,調零組、空白對照組加100 μL不含血清的1640培養基,陽性對照組加100 μg/mL的順鉑100 μL,其他給藥組每孔分別加入0.125,0.25,0.5,1,2 mg/mL的藥物100 μL,每個濃度的藥物重復5個孔,其中以發酵蜈蚣醇提液作為對照組。然后細胞在37 ℃、5%二氧化碳培養箱中繼續培養。24 h后,每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL于培養箱內避光反應4 h。吸去上清液,加入100 μL DMSO,用酶標儀于490 nm測定OD值,按下式計算藥物對細胞的抑制率[11]。

細胞抑制率(%)=[1-(加藥組OD-調零組)/(空白組OD-調零組)]×100

1.2.7 數據處理 數據用SPSS 17.0單因素方差、多因素方差分析進行處理。

2 結果與分析

2.1 標準曲線實驗結果

蘆丁對照品溶液在吸光度0.2～0.7 L/(g·cm)線性范圍內成良好線性關系,線性回歸方程為A=0.9543C,其中A為吸光度,C為黃酮含量(mg/mL),線性相關系數為r=0.9996。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 提取溫度對總黃酮提取量的影響 由圖1可知,隨著提取溫度的上升,發酵蜈蚣粉中總黃酮的得率呈現先上升后下降的趨勢,溫度為80 ℃ 時總黃酮得率達到最大,在提取溫度超過80 ℃ 后,總黃酮得率逐漸下降,下降至90 ℃ 后趨于穩定。是因為從較低溫度升至 80 ℃,熱效率升高,分子運動加快,利于黃酮的破壁溶出;但隨著溫度的繼續升高,會引起黃酮類化合物結構被破壞,部分蛋白凝固從而不利于黃酮溶出,故得率降低。據此,選定70、80、90 ℃ 作為正交實驗中提取溫度的三個水平[12-14]。

圖1 提取溫度對發酵蜈蚣粉總黃酮得率的影響Fig.1 The effect of temperature on the yield of total flavonoids

2.2.2 料液比對總黃酮提取量的影響 由圖2可知,隨著溶劑量的增加,總黃酮得率呈現先升高后平穩的趨勢。當料液比低于1∶35 (g∶mL)時,提取總黃酮得率隨著料液比的增大而增大,這是因為得率的高低與黃酮向溶劑擴散的難易程度有關,料液比小,溶劑量少,導致兩相界面間的濃度差小,不利于黃酮的擴散。但當料液比高于1∶35 (g∶mL)時,提取總黃酮得率隨料液比的增大增長趨勢明顯降低,這說明一定比例的溶劑即可將有效成分提取完全。因此,選定1∶30、1∶35、 1∶40 (g∶mL)作為正交實驗中料液比的三個水平[15-17]。

圖2 料液比對發酵蜈蚣粉總黃酮得率的影響Fig.2 The effect of solid on the yield of total flavonids

2.2.3 提取時間對總黃酮提取量的影響 由圖3可知,隨著時間的增加,發酵蜈蚣粉中總黃酮得率在提取時間是0.5～1 h時十分平穩,而從1 h開始明顯增高,可見提取時間越長,提取越充分。當提取時間超過2 h后,黃酮得率趨于穩定,可見,當提取時間達到一定長度黃酮溶出量便達到飽和,不再明顯溶出。因此,選定1.5、2、2.5 h作為正交實驗中提取時間的三個水平[18-21]。

圖3 提取時間對發酵蜈蚣粉總黃酮得率的影響Fig.3 The effect of times of extraction on the yield of total flavonoids

2.3 正交實驗

根據單因素實驗結果,選取影響發酵蜈蚣粉總黃酮提取因素中有意義的水平做正交實驗,對結果進行極差分析,以確定最佳提取工藝條件。采用 L9(34)正交因子水平表(見表1),設計L9(34)正交實驗,實驗結果見表2。

表2 正交實驗優化條件下發酵蜈蚣粉中總黃酮得率Table 2 The yield of total flavonoids under orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

注:*表示有顯著性差異,p<0.05。

結合文獻[22]，由極差和方差分析結果可知,以總黃酮得率為評價指標,進行直觀分析發現,各因素對總黃酮提取得率的影響順序為B>A>C,方差分析表明,因素B對實驗結果有顯著性影響。因此此次實驗回流提取總黃酮的最佳條件為A2B3C3,即料液比為 1∶40 (g∶mL),提取溫度為80 ℃,提取時間為2.5 h。

2.4 最佳工藝條件的驗證

根據所篩選的最佳工藝條件提取發酵蜈蚣粉3批,按照1.2.1下的方法測定總黃酮得率,實驗結果見表4。

表4 驗證實驗結果Table 4 Verify the experimental results

RSD為1.9%,小于5%,說明該工藝條件穩定可行。

2.5 MTT法測定體外抗腫瘤活性

MTT法測定最佳工藝下發酵蜈蚣粉醇提液對肺腺癌A549細胞的抑制作用結果見圖4。

圖4 順鉑及不同濃度發酵蜈蚣醇提液對肺腺癌A549細胞的抑制率Fig.4 The inhibition ratio of cis-platinum and different concentration of alcohol extraction of fermented centipede powder to lung adenocarcinoma cell A549

由圖4可看出在濃度為0.25 mg/mL后抑制率隨濃度的增大不斷增大,在不同濃度下發酵蜈蚣醇提液對肺腺癌A549細胞的抑制率均大于順鉑,并且在濃度為2 mg/mL時抑制效果在實驗條件下達到最佳。此現象表明蜈蚣醇提液對肺腺癌A549細胞具有較優抑制效果,初步認為是醇提液總黃酮發揮的藥理藥效,具體原因及是否具有依賴性有待進一步實驗研究。

3 結論與討論

研究表明,黃酮類化合物具有抗炎、抑制癌細胞基因表達的作用[23]。近年來,隨著抗腫瘤藥理作用研究的不斷深入,其在臨床抗腫瘤的應用上也更加廣泛。對蟲類中藥的發酵處理能夠對中藥材中原有的成分進行修飾和轉化,或者產生有效的次生代攝物質,從而改變原藥性能、產生新的藥理作用等。預實驗研究表明,發酵可以使中藥蜈蚣黃酮極大地增加(相關研究未發表)。因此本實驗選用發酵后蜈蚣粉,以總黃酮得率為指標優化其提取工藝并對其進行抗腫瘤作用研究具有一定的創新性。

黃酮不溶于水,易溶于乙醇等有機溶劑,因此本實驗主要選用醇溶液提取,而對于其他有機溶劑的提取效果還有待進一步研究。用醇溶液進行提取時,脂溶性物質如黃酮類可被大量溶出,因此以黃酮類化合物得率為指標確定最佳提取工藝。中藥提取大多選用80%的乙醇濃度。醇提發酵蜈蚣的主要目的是盡可能全面地提取有代表性的脂溶性成分,超過80%的乙醇濃度就會有多肽和蛋白溶出。因為接下來的實驗研究中發酵蜈蚣還要考察水溶性物質的藥理活性,所以盡可能地將脂溶性的物質提取出來,同時又盡可能將水溶性的蛋白保留下來,用80%的乙醇進行提取,可以同時兼顧脂溶與水溶物質,其水溶性部分的相關研究有待于今后的進一步推動。

實驗采用正交實驗法優化發酵蜈蚣粉中總黃酮的提取工藝條件。不同量的溶劑會影響黃酮的溶出量,實驗結果表明料液比是影響黃酮提取的關鍵性因素。用最佳提取工藝,料液比1∶40 (g∶mL),提取時間2.5 h,提取溫度80 ℃ 取得的發酵蜈蚣粉中的總黃酮得率為1.970%。通過體外抗腫瘤藥理實驗證明:蜈蚣醇提液對肺腺癌A549細胞的抑制率均大于順鉑,具有較優良的抗腫瘤效果,蜈蚣醇提液體外對腫瘤細胞的抑制有無劑量依賴關系還有待研究。

本實驗采用回流提取的方法,對超聲提取、索氏提取及浸漬法提取等其他提取方法的研究還有待進行。近年來,探究蜈蚣體內的抗腫瘤活性成分一直是蜈蚣研究的熱點,可能由于蜈蚣醇提液對肺腺癌A549細胞有一定毒副作用,并未于臨床大量應用。從目前文獻報道來看,蜈蚣的生藥學鑒別研究方面還存在不足,整體報道的僅有少棘巨蜈蚣的鑒別研究,對于其他幾種蜈蚣的研究則少之甚少,有待于今后在研究中加強。

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Optimization of total flavonoids extraction process in centipede fermentation by orthogonal test

WANG Yan-duo1,LIU Chun-yu1,LV Shi-jie1,WANG Ying1,WANG Li-na1,WANG Ji-hui2，*

(1.College of pharmacy,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China; 2.The experiment center of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan,250355,China)

Objective:Orthogonal experiment is used to optimize the extraction process of total flavonoids from fermented centipede powder. Method:Regarding the yield of total flavonoids from fermented centipede as the research index. On the basic of single-factor test,the ultrasonic-assisted extraction process parameters of total flavonoids from fermented centipede including the ratio of extractive temperature(A),the ratio of material(B)and extractive time(C)were optimized by orthogonal test and the yield of total flavonoids was used as the responsive values. The antineoplastic activity of extraction to lung adenocarcinoma cell A549 were measured by using MTT assayinvitro.Result:The order of the effect of these factors on the yield of total flavonoids from fermented centipede powder was the ratio of material>extractive temperature>extractive time. In this experiment,the best extractive process was under 80 ℃ of the extractive temperature,1∶40 (g∶mL) of the ratio of material,2.5 h of the extraction time. Under these conditions,the yield of total flavonoids was 1.970%. The inhibition ratio of different concentration of alcohol extraction of fermented centipede powder to lung adenocarcinoma cell A549 was all greater than cis-platinum,and it had good antineoplasmic activity.

fermented centipede powder;orthogonal test;reflux extraction;total flavonoids;assay of MTT;lung adenocarcinoma A549 cell line

2016-11-11

王彥多(1997-)，女，本科，研究方向：中藥學， E-mail：m17864190855@163.com。

*通訊作者:王集會(1962-)，男，本科，副教授，研究方向：蟲類中藥發酵及活性成分研究，E-mail：wangjihui10@126.com。

山東中醫藥大學大學生研究訓練(SRT)計劃資助項目(校編號：2016054，國家編號：201610441048)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0183-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.027