響應面法優化白薇抑菌物質超聲提取工藝

彭 旋,萬春鵬,陳玉環,陳楚英,陳金印,*

(1.江西省果蔬采后處理關鍵技術與質量安全協同創新中心,江西農業大學農學院,江西南昌 330045; 2.江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室,江西農業大學農學院,江西南昌 330045)

響應面法優化白薇抑菌物質超聲提取工藝

彭 旋1,2,萬春鵬1,2,陳玉環1,2,陳楚英1,2,陳金印1,2,*

(1.江西省果蔬采后處理關鍵技術與質量安全協同創新中心,江西農業大學農學院,江西南昌 330045; 2.江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室,江西農業大學農學院,江西南昌 330045)

為研究白薇抑菌物質的提取工藝條件,實驗以白薇為原料,意大利青霉菌為供試菌,抑菌圈直徑為指標,采用超聲波輔助浸提白薇抑菌物質。在單因素實驗基礎上,研究響應面分析法(Response Surface Methodology,RSM)優化超聲波輔助提取白薇抑菌物質的工藝參數。結果表明:白薇抑菌物質的最佳提取工藝為乙醇濃度50%,浸提時間2 h,液料比31,浸提溫度69 ℃,在此條件下,白薇提取液對意大利青霉抑菌圈直徑達到40.58 mm,與理論最優值40.81 mm接近。

白薇,響應面法,超聲波提取,意大利青霉

白薇(CynanchumatratumBunge)為蘿藦科鵝絨藤屬植物直立白薇或蔓生白薇的干燥根莖,具有清熱涼血、利尿通淋、解毒療瘡的功效[1],常用于溫邪傷營發熱、陰虛發熱等癥狀的治療。國內外對白薇的研究目前主要集中在化學成分和藥理作用方面。對白薇化學成分的分析發現,白薇含有C21甾體皂苷、白薇素、揮發油、強心苷等成分[2],其中主要為C21甾體皂苷[3-4]。對白薇藥理作用的研究發現,C21甾體皂苷具有抗炎、鎮痛、退熱和抗腫瘤等藥理作用[5-7]。陳楚英等人[8]研究發現白薇對柑橘采后致病菌意大利青霉(Penicilliumitalicum)具有良好抑制效果,表明白薇含有意大利青霉的抑菌物質。通過一定的提取方法和工藝可以獲得抑菌物質,傳統提取方法有水蒸氣蒸餾法[9]和有機溶劑提取法[10],但水蒸氣蒸餾法溫度較高,會導致抑菌物質受熱分解,提取率較低,而有機溶劑提取法存在溶劑殘留問題;超聲波具有強烈振動、強化的空化效應和攪拌作用,可以加快抑菌物質的浸出,大大縮短提取時間,因而被廣泛用于藥用植物活性成分的提取[11]。

中藥有效成分的提取往往受多種因素及其交互作用的影響,傳統的正交設計得不到有關因子和響應值的回歸方程,而均勻設計沒有考慮全部交互作用,結果不穩定;響應面分析法采用多元二次回歸方程擬合因子和響應值之間的函數關系,能研究因子間的交互作用,且實驗次數少、周期短、精度高,優勢突出[12]。因此,本實驗以抑菌圈直徑為響應值,采用響應面分析法優化白薇抑菌物質超聲波提取工藝,選出最佳工藝參數,為工業生產提供理論依據以及為后續白薇抑菌物質分離鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白薇 江西省樟樹市華豐藥業有限公司,粉碎,過40目篩,藥粉常溫保存備用;意大利青霉菌 江西農業大學植物病理實驗室提供;無水乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、石油醚、葡萄糖、瓊脂 均為市售分析純藥劑。

SHZ-D(Ⅲ)循環水真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司,ROTAVAPOR R-3旋轉蒸發儀 瑞士BUCHI公司,AUY220電子天平 日本島津公司,KQ-500B超聲波清洗機 昆山超聲儀器有限公司,YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司,MIR-254恒溫培養箱 日本三洋,HS-1300U超凈工作臺 蘇靜集團蘇州安泰公司,FW100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 意大利青霉菌種活化及孢子懸浮液的制備 在無菌環境中挑取意大利青霉白色菌絲接種至PDA培養基上,放置28 ℃恒溫培養箱培養一周后(菌種活化),用無菌水將意大利青霉菌洗入三角瓶中,用普通玻璃珠將孢子打散,過濾,將濾液充分搖勻制成孢子懸浮液,血球計數板計數,使菌懸液孢子濃度為108個/mL[13]。

1.2.2 白薇提取液抑菌效果的測定 采用杯碟法[14]測定白薇提取液的抑菌效果。無菌環境下,往未凝固的100 mL PDA培養基中加入1 mL意大利青霉菌懸液,搖勻倒入平板。待培養基凝固后,吸取200 μL濃度為1 g/mL的白薇提取液于牛津杯中,重復三次。將平板放置28 ℃的恒溫培養箱中培養2 d,采用十字交叉法測量抑菌圈直徑,抑菌圈直徑越大,說明抑菌效果越好,提取液中抑菌物質越多。

1.2.3 提取溶劑的選擇 稱取5 g白薇藥粉置于6個三角瓶中,而后分別加入100 mL的蒸餾水、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚溶液,用封口膜封住瓶口,常溫下超聲波(40 kHz)輔助浸提2 h。將浸提液抽濾、旋轉蒸發儀濃縮(45 ℃、-0.09 MPa)制成1 g/mL各提取溶劑的白薇提取液,測定其對意大利青霉的抑菌效果。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 乙醇濃度對白薇提取液抑菌效果的影響 稱取5 g白薇藥粉置于5個三角瓶中,而后分別加入液料體積質量比(液料比)為20的30%、40%、50%、60%和70%乙醇溶液,用封口膜封住瓶口,置于40 ℃溫度下超聲波輔助浸提1.5 h。將浸提液抽濾、濃縮制成1 g/mL的白薇提取液,測定其對意大利青霉的抑菌效果。

1.2.4.2 浸提時間對白薇提取液抑菌效果的影響 稱取5 g白薇藥粉置于5個三角瓶中,而后加入液料比為20的50%乙醇溶液,用封口膜封住瓶口,置于40 ℃溫度下,分別超聲波輔助浸提1、1.5、2、2.5和3 h。浸提結束后抽濾、濃縮制成1 g/mL的白薇提取液,測定其對意大利青霉的抑菌效果。

1.2.4.3 液料比對白薇提取液抑菌效果的影響 稱取5 g白薇藥粉置于5個三角瓶中,而后分別加入液料比為10、20、30、40和50的50%乙醇溶液,用封口膜封住瓶口,置于40 ℃溫度下超聲波輔助浸提2 h。將浸提液抽濾、濃縮制成1 g/mL的白薇提取液,測定其對意大利青霉的抑菌效果。

1.2.4.4 浸提溫度對白薇提取液抑菌效果的影響 稱取5 g白薇藥粉置于5個三角瓶中,而后加入液料比為30的50%乙醇溶液,用封口膜封住瓶口,分別置于40、50、60、70、80 ℃溫度下,超聲波輔助浸提2 h。浸提結束后抽濾、濃縮制成1 g/mL的白薇提取液,測定其對意大利青霉的抑菌效果。

1.2.5 響應面優化提取工藝的設計 綜合乙醇濃度、浸提時間、液料比和浸提溫度這四個單因素實驗結果,根據Design Expert軟件中Box-Behnken的中心組合設計原理,采用響應面法設計了4因素3水平的實驗對白薇抑菌物質的提取工藝條件進行優化,以意大利青霉為指示菌,抑菌圈直徑大小為響應值,實驗重復三次。實驗因子和水平見表1。

表1 Box-Benhnken設計因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken experimental design

1.3 數據統計與分析

采用Excel 2003制圖、SPSS 17.0對單因素實驗數據進行Duncan多重比較分析以及Design Expert 8.0.6.1對響應面實驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

不同提取溶劑的白薇提取液抑菌效果如圖1所示,從圖1中可以看出,石油醚、氯仿和乙酸乙酯的白薇提取液無抑菌效果,丙酮、乙醇和蒸餾水的白薇提取液有較好的抑菌效果,且蒸餾水和無水乙醇的白薇提取液抑菌效果顯著(p<0.05)好于丙酮的白薇提取液。另外,丙酮具有一定的毒性、價格相對較高,又因可以制毒、制爆,受公安部門管制,而蒸餾水的濃縮效率低,從工業生產獲取難易程度、安全性、成本及提取效率考慮,實驗選用無水乙醇、蒸餾水混合溶液作為提取溶劑。

圖1 不同溶劑白薇提取液抑菌效果Fig.1 Antibacterial activity of the cynanchum atratum extracts with different solvents

圖2 乙醇濃度(A)、浸提時間(B)、液料比(C)、浸提溫度(D)對白薇提取液抑菌效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration(A),extraction time(B),liquid-to-material ratio(C), extraction temperature(D)on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 乙醇濃度對白薇提取液抑菌效果的影響 由圖2A可知,隨著乙醇濃度的升高,白薇提取液的抑菌效果呈現先上升后下降的變化趨勢,在乙醇濃度為50%時,抑菌圈直徑最大,抑菌效果最好,顯著(p<0.05)好于其它濃度。濃度超過50%,抑菌效果減弱,可能是因為一些親脂性強、醇溶性雜質成分增大浸出,從而影響了抑菌物質的提取率[15]。因此實驗將50%的乙醇濃度作為最佳的提取濃度。

2.2.2 浸提時間對白薇提取液抑菌效果的影響 在1～2 h的浸提時間內,隨著浸提時間的增加,白薇提取液的抑菌圈直徑也隨之增大(見圖2B)。在浸提時間為2 h時,抑菌效果顯著(p<0.05)好于其它浸提時間。當浸提時間超過2 h,抑菌效果隨浸提時間的增加而減弱,這可能是后期抑菌物質已充分浸出,而非抑菌成分繼續浸出,降低了抑菌物質的提取率[16]。因此實驗將浸提時間2 h作為最佳浸提時間。

2.2.3 液料比對白薇提取液抑菌效果的影響 不同液料比的白薇提取液對意大利青霉的抑菌效果見圖2C,液料比從10增加到30,白薇提取液的抑菌圈直徑逐漸增大,抑菌效果逐漸增強,繼續增大液料比,抑菌效果迅速下降,這可能是當擴散平衡后,增加提取劑的量不會再增加抑菌物質的浸出,而非抑菌物質會增加浸出,這樣最后濃縮,會降低白薇提取液中抑菌物質的提取率[17]。因此實驗將液料比30最為最佳料液比。

2.2.4 浸提溫度對白薇提取液抑菌效果的影響 不同浸提溫度的白薇提取液對意大利青霉的抑菌效果如圖2D所示,在40～70 ℃范圍內,白薇提取液的抑菌圈直徑隨著浸提溫度的上升明顯增大,浸提溫度70 ℃時,白薇提取液的抑菌效果最好,顯著(p<0.05)好于其它浸提溫度,溫度再升高,白薇提取液的抑菌圈直徑下降,這可能是由于抑菌物質的結構被破壞[18]。因此實驗將浸提溫度70 ℃作為最佳浸提溫度。

2.3 響應面法優化白薇抑菌物質的超聲波提取工藝

2.3.1 響應面實驗設計方案與結果 按表1的設計方案,實驗結果如表2。

表2 響應面實驗設計方案與結果Table 2 Experimental design and results of the Box-Benhnken test

2.3.2 模型的建立及顯著性檢驗 用Design Expert 8.0.6.1軟件對表2中的數據進行多元回歸擬合,得到抑菌圈直徑(Y)對乙醇濃度(A)、浸提時間(B)、液料比(C)和浸提溫度(D)的模型回歸方程:

Y=40.77-0.063A+0.33B+0.11C-0.21D+0.53AB+0.72AC+0.94AD-0.69BC+0.031BD-1.57CD-1.05A2-1.64B2-1.47C2-1.62D2(R2=0.9652)

從方程可以看出響應值與實驗因子之間不是簡單線性關系,而是呈二次拋物線關系。方程中存在AB、AC、AD、BC、BD、CD項,說明各因子間存在交互作用,此外方程的決定系數R2=0.9652,表明96.52%的數據可用此方程解釋,說明該模型與實際實驗擬合良好。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.3.3 響應面分析與優化 利用Design Expert 8.0.6.1軟件,根據回歸模型作響應曲面及等高線,結果見圖3～圖8。若一個響應曲面的坡度非常陡峭,表明形成該坡度曲面的兩個因子對響應值有顯著影響,從另一個方面表明這兩個因子間存在較強的交互作用[20]。另外,等高線近似圓形,表明兩個因子對響應值無顯著影響,且兩個因子間無顯著交互作用;而等高線呈橢圓形,表明兩個因子對響應值具有顯著影響,且兩個因子間有顯著交互作用[21]。

從圖3～圖8的響應面圖中可以看出,AD項、CD項所形成的曲面比較陡峭,表明AD項、CD項對抑菌圈直徑有顯著影響。

圖3 乙醇濃度與浸提時間對抑菌效果影響的響應面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot for the effects of ethanol concentration and extraction time on antibacterial activity of the cynanchum atratum extracts

圖4 乙醇濃度與液料比對抑菌效果影響的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot for the effects of ethanol concentration and liquid-to-material ratio on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

圖5 乙醇濃度與浸提溫度對抑菌效果影響的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot for the effects of ethanol concentration and extraction temperature on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

圖6 浸提時間與液料比對抑菌效果影響的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot for the effects of extraction time and liquid-to-material ratio on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

圖7 浸提時間與浸提溫度對抑菌效果影響的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot for the effects of extraction time and extraction temperature on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

圖8 液料比與浸提溫度對抑菌效果影響的響應面圖和等高線圖Fig.8 Response surface plot and contour plot for the effects of liquid-to-material ratio and extraction temperature on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

從圖3～圖8的等高線圖中可以看出,除了BD項的等高線近似圓形,其它交互項的等高線均為橢圓形,表明除了BD項對抑菌圈直徑無顯著影響,其它交互項對抑菌圈直徑均有顯著影響,這和模型方差分析的結果一致。

由響應面的分析可知,回歸模型存在最大值。通過軟件分析計算得出理論最佳提取工藝:乙醇濃度49.66%,浸提時間2.04 h,液料比30.68,浸提溫度68.92 ℃,理論抑菌圈直徑為40.81 mm。

2.3.4 最優條件的驗證 為檢驗響應面法的可行性,采用最佳提取工藝進行驗證,同時考慮實際操作方便,實驗以乙醇濃度50%,浸提時間2 h,液料比31,浸提溫度69 ℃進行驗證,3次重復實驗抑菌圈直徑平均值為40.58 mm,落于模型理論值的95%置信區間(40.4398～41.1702 mm)內。

3 結論

實驗在單因素實驗的基礎上,采用響應面法對超聲波輔助提取白薇抑菌物質的工藝進行優化。實驗發現:AC項、AD項、BC項、CD項、A2項、B2項、C2項、D2項對抑菌圈直徑有極顯著(p<0.01)的影響,AB項對抑菌圈直徑有顯著(p<0.05)的影響。此外,得到方便實際操作的最佳提取工藝:乙醇濃度50%,浸提時間2 h,液料比31,浸提溫度69 ℃,抑菌圈直徑為40.58 mm。在此條件下的抑菌圈直徑落于模型理論值的95%置信區間內。

[1]呂永海,楊赟,嚴詩楷,等. 大孔吸附樹脂法富集白薇中總皂苷的工藝研究[J]. 中國中藥雜志,2008,33(12):1390-1393.

[2]袁鷹,張衛東,柳潤輝,等. 白薇的化學成分和藥理研究進展[J]. 藥學實踐雜志,2007,25(1):6-9.

[3]鄭兆廣,柳潤輝,張川,等. 蔓生白薇中的C21甾苷類成分[J]. 中國天然藥物,2006,4(5):338-343.

[4]雷輝,王永兵,肖功勝,等. 蔓生白薇有效部位化學成分研究[J]. 中藥材,2014,37(10):1798-1800.

[5]Zhang Z X,Zhou J,Hayashi K,et al. Studies on the constituents of Asclepiadaceae plants. LVIII. The structures of five glycosides,cynatratoside-A,-B,-C,-D,and-E,from the Chinese drug “Pai-Wei,” Cynanchum atratum BUNGE[J]. Chemical and pharmaceutical bulletin,1985,33(4):1507-1514.

[6]Zhang Z X,Zhou J,Hayashi K,et al. Atratosides A,B,C and D,steroid glycosides from the root of Cynanchum atratum[J]. Phytochemistry,1988,27(9):2935-2941.

[7]Bai H,Li W,Asada Y,et al. Twelve pregnane glycosides from Cynanchum atratum[J]. Steroids,2009,74(2):198-207.

[8]陳楚英,彭旋,陳玉環,等. 21種藥用植物提取物對柑橘青霉病抑菌作用的篩選及白薇醇提物對臍橙青霉病的防治效果[J]. 植物保護學報,2016,43(4):614-620.

[9]劉繼鑫,王克霞,李朝品. 水蒸氣蒸餾法提取中藥揮發油存在的問題及解決方法[J]. 時珍國醫國藥,2008,19(1):97-98.

[10]趙恒強,陳軍輝,郭秀春,等. 加速溶劑萃取法快速提取黃連中的生物堿[J]. 分析實驗室,2008,27(11):5-9.

[11]戴喜末,熊子文,羅麗萍. 響應面法優化野艾蒿多糖的超聲波提取及其抗氧化性研究[J]. 食品科學,2011,32(8):93-97.

[12]彭曉霞,路莎莎. 響應面優化法在中藥研究中的應用和發展[J]. 中國實驗方劑學雜志,2011(19):296-299.

[13]Wan C P,Zhou M J,Chen J Y. Antibacterial activity of pomegranate peel and its application on food fresh keeping[J]. Food & Fermentation Industries,2013,39(6):130-134.

[14]du Plooy W,Regnier T,Combrinck S. Essential oil amended coatings as alternatives to synthetic fungicides in citrus postharvest management[J]. Postharvest Biology and Technology,2009,53(3):117-122.

[15]胡筱,李春陽,周濤. 響應面法優化藍莓葉抑菌物質的提取工藝[J]. 食品工業科技,2012,33(6):309-312.

[16]胡林子,蔣雨,馬永全,等. 響應面優化超聲波提取山毛豆抑菌物質條件研究[J]. 食品科學,2010,31(22):91-95.

[17]林建原,季麗紅. 響應面優化銀杏葉中黃酮的提取工藝[J]. 中國食品學報,2013,13(2):83-90.

[18]Jeong G T,Kim D H,Park D H. Response surface methodological approach for optimization of free fatty acid removal in feedstock[J]. Applied biochemistry and biotechnology,2007,137(1-12):583-593.

[19]蔣雨,陳安均,于新,等. 響應面法優化微波提取野菊花抑菌物質工藝[J]. 食品科學,2010,31(22):59-63.

[20]楊佳,張國文,汪佳蓉,等. 響應面分析法優化超聲提取贛南臍橙皮中黃酮類化合物的工藝研究[J]. 食品科學,2009,30(16):94-97.

[21]楊文鴿,謝果凰,顏偉華,等. 響應面分析法優化海鰻的濕腌工藝[J]. 中國食品學報,2010,10(1):133-139.

Optimization of ultrasound extraction of antibacterial material fromCynanchumatratumBunge with response surface methodology

PENG Xuan1,2,WAN Chun-peng1,2,CHEN Yu-huan1,2,CHEN Chu-ying1,2,CHEN Jin-yin1,2,*

(1.Collaborative Innovation Center of Post-harvest Key Technology and Quality Safety of Fruits and Vegetables in Jiangxi Province,College of agronomy,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China; 2.Jiangxi Key Laboratory for Postharvest Technology and Nondestructive Testing of Fruits & Vegetables, College of agronomy,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

In order to study the conditions of extracting antibacterial material fromCynanchumatratum,C.atratumwas used as material,the diameter of inhibition zone andPenicilliumitalicumworked as an indicator and bacterial strain in this experiment respectively,beside these ultrasound-assisted extraction was used to antibacterial material fromC.atratum. On the basis of single factor tests,the method of response surface methodology was used to optimize ultrasound-assisted extraction of antibacterial material formC.atratum. The result indicated that the optimal conditions to extract antibacterial material fromC.atratumwere that ethanol concentration was 50%,extraction time was 2 h,liquid-to-material ratio was 31 and extraction temperature was 69 ℃. Under these conditions,the inhibitory effect againstP.italicumbyC.atratumextracts was 40.58 mm,close to the theoretically predicted value of 40.81 mm.

Cynanchumatratum;response surface methodology;ultrasound extraction;Penicilliumitalicum

2016-09-14

彭旋(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：果蔬植物源保鮮劑開發與利用，E-mail：pengx1104@163.com。

*通訊作者:陳金印(1962-)，男，博士，教授，研究方向：果蔬采后生理及貯藏技術，E-mail：jinyinchen@126.com。

“十二五”國家科技支撐計劃項目 (2012BAD38B03-2)；江西省教育廳科技落地計劃項目(111)；江西省“贛鄱英才555工程”(2012)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0176-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.026