κ卡拉膠寡糖酶解制備工藝優(yōu)化

張雪芳,余 倩,吳昌正,2,3,4,肖 瓊,2,3,4,朱艷冰,2,3,4,肖安風(fēng),2,3,4,*

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建廈門(mén) 361021; 2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén) 361021; 3.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心,福建廈門(mén) 361021; 4.廈門(mén)市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén) 361021)

張雪芳1,余 倩1,吳昌正1,2,3,4,肖 瓊1,2,3,4,朱艷冰1,2,3,4,肖安風(fēng)1,2,3,4,*

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建廈門(mén) 361021; 2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén) 361021; 3.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心,福建廈門(mén) 361021; 4.廈門(mén)市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén) 361021)

為改進(jìn)卡拉膠寡糖的制備工藝,本研究以κ-卡拉膠為底物,采用酶法制備κ-卡拉膠寡糖,以還原糖生成量為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化,并采用薄層色譜法及質(zhì)譜對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果顯示酶解反應(yīng)最優(yōu)工藝條件為:底物濃度12 g/L、pH7.0、反應(yīng)溫度40 ℃、振蕩速率100 r/min,經(jīng)優(yōu)化后的酶解反應(yīng)更完全,還原糖生成量由0.91 mg/mL提高至1.61 mg/mL,提高了77%,酶解卡拉膠反應(yīng)的Km值為171.96 mg/mL,最大反應(yīng)速度Vmax為0.925 mg·mL-1·min-1。最優(yōu)工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和20 L放大實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,經(jīng)薄層色譜及質(zhì)譜分析酶解24 h后的反應(yīng)主產(chǎn)物為二糖和四糖。

卡拉膠,卡拉膠寡糖,酶水解

卡拉膠(Carrageenan)是從紅藻細(xì)胞壁中提取的一種水溶性線(xiàn)性硫酸半乳聚糖,具有以1,3-β-D-半乳糖和1,4-α-D-半乳糖交替連接形成的骨架結(jié)構(gòu),其分子量為105～106u。根據(jù)是否含有3,6-內(nèi)醚半乳糖、硫酸根含量及硫酸根所在位置,主要將卡拉膠分為κ-、λ-、τ-三族[1-2]。

卡拉膠作為一種天然海藻多糖,因其安全、無(wú)毒,可生物降解、自然界存在量大,及特殊的理化特性而在食品、藥品和化妝品等行業(yè)大量應(yīng)用[3]。然而,由于卡拉膠分子量大,溶解性及吸收性差,從而影響卡拉膠的生物活性并限制了卡拉膠的進(jìn)一步應(yīng)用。研究表明,經(jīng)降解或改性得到的卡拉膠寡糖或低聚糖及衍生物具有抗?jié)儭⒖共《尽⒖鼓[瘤、抗凝血[4-7]等多種作用,生物活性與利用率得到更大提高[8]。

由于對(duì)寡糖、低聚糖的制備技術(shù)研究還不夠成熟,制備成本高,限制了寡糖、低聚糖規(guī)模化應(yīng)用生產(chǎn)[9]。因此,研究或改進(jìn)生產(chǎn)制備工藝、降低成本、提高得率是寡糖、低聚糖擴(kuò)大應(yīng)用的關(guān)鍵。目前,卡拉膠的降解方式主要有化學(xué)降解法,如:氧化降解[10]、酸降解[11]等;物理降解法,如:輻照降解[12]、微波降解[13]等;菌解法[14]或酶法降解[15],酶法降解具有底物專(zhuān)一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)過(guò)程易于控制等優(yōu)點(diǎn),具有更強(qiáng)的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)[16]。本文利用產(chǎn)κ-卡拉膠酶的食鹿角菜假交替單胞菌(Pseudoalteromonascarrageenovora)ASY5發(fā)酵獲得κ-卡拉膠酶,利用κ-卡拉膠酶酶解κ-卡拉膠,通過(guò)控制反應(yīng)條件,改進(jìn)κ-卡拉膠寡糖的制備工藝并對(duì)其進(jìn)行定性分析從而實(shí)現(xiàn)快速、高效地制備不同平均聚合度的κ-卡拉膠寡糖。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卡拉膠 綠新(福建)食品有限公司;半乳糖、硫酸、鹽酸、苯酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、三羥基氨基甲烷(Tris) 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司。

UV-2600A型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;TD5M-WS臺(tái)式離心機(jī) 湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司;pH211C酸度計(jì) 北京哈納科儀科技有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司;20L酶反應(yīng)罐 鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 卡拉膠粗酶液的制備 卡拉膠粗酶液:由實(shí)驗(yàn)室能產(chǎn)卡拉膠酶的食鹿角菜假交替單胞菌(Pseudoalteromonascarrageenovora)ASY5菌株發(fā)酵制備。取卡拉膠降解菌純培養(yǎng)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,20 ℃振蕩培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液9800×g離心10 min,取上清作為粗酶液。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取一定質(zhì)量的卡拉膠溶于pH7.0的磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L)中,配制成8 g/L的卡拉膠溶液,從中取18 mL溶液,加入2 mL酶活為3.0 U/mL的粗酶液(以加入2 mL滅活酶液做空白對(duì)照),在一定溫度下水解反應(yīng)60 min,每10 min取1 mL酶解液,立即沸水浴10 min滅酶活終止反應(yīng),測(cè)定還原糖含量,并計(jì)算反應(yīng)過(guò)程中平均聚合度的變化。在酶解液pH7.0、反應(yīng)溫度40 ℃、振蕩速率100 r/min的條件下,考察不同底物濃度(4、6、8、10、12、14 g/L)在卡拉膠酶水解過(guò)程中對(duì)還原糖生成量的影響;在底物濃度12 g/L、反應(yīng)溫度40 ℃、振蕩速率100 r/min的條件下,考察不同酶解液pH(6.5、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5)在卡拉膠酶水解過(guò)程中對(duì)還原糖生成量的影響;在底物濃度12 g/L、pH7.0、振蕩速率100 r/min的條件下,考察不同反應(yīng)溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)在卡拉膠酶水解過(guò)程中對(duì)還原糖生成量的影響;在底物濃度12 g/L、pH7.0、反應(yīng)溫度40 ℃的條件下,考察不同振蕩速率(0、80、100、140、160 r/min)在卡拉膠酶水解過(guò)程中對(duì)還原糖生成量的影響。進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察各因素對(duì)κ-卡拉膠寡糖生成量的影響。

1.2.3 卡拉膠酶水解卡拉膠動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 分別配制底物濃度為4～14 g/L的卡拉膠溶液,以卡拉膠溶液為底物,卡拉膠酶為催化劑,在最優(yōu)反應(yīng)條件下進(jìn)行水解反應(yīng)。從加入酶液開(kāi)始計(jì)時(shí)每2 min取樣一次,立即于100 ℃水浴10 min滅酶活終止反應(yīng)。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法測(cè)定水解液中還原糖的生成量。運(yùn)用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求出Km值和Vmax值[17]。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 卡拉膠酶活力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[18]的方法,取0.05 mL酶液加入到0.45 mL 0.5%卡拉膠溶液(0.05 g卡拉膠溶于10 mL濃度0.05 mol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液)中,60 ℃反應(yīng)20 min,100 ℃滅酶活10 min終止反應(yīng),采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖生成量。以滅活的酶液作為空白對(duì)照。在本實(shí)驗(yàn)條件下,每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.3.2 還原糖含量和總糖含量測(cè)定 采用DNS法測(cè)還原糖含量[17]。精確稱(chēng)取葡萄糖0.1 g放入100 mL容量瓶中配制成0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)摩爾濃度溶液,分別吸取0.0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL置于具塞試管中,每組做三個(gè)平行,加DNS溶液混勻后于100 ℃顯色5 min,冷卻后加蒸餾水補(bǔ)足體積至5 mL,于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到卡拉膠還原糖含量。

采用苯酚-硫酸法測(cè)總糖含量[19]。配制0.1 mg/mL半乳糖溶液,分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于具塞試管中,并加入蒸餾水保持每支試管體積相同。然后加入6%苯酚0.5 mL,混勻后快速加入濃硫酸2.5 mL,混勻,室溫條件下靜置30 min,每組做三個(gè)平行,于波長(zhǎng)590 nm處測(cè)吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算即可得到卡拉膠總糖含量。

1.3.3 平均聚合度測(cè)定 平均聚合度=總糖含量/還原糖含量[20]。

1.3.4 卡拉膠降解產(chǎn)物的組成和結(jié)構(gòu)分析 薄層層析(TLC)分析[20]:硅膠板于110 ℃活化1 h,將寡糖樣品進(jìn)行毛細(xì)管點(diǎn)樣,展開(kāi)劑為:正丁醇∶冰醋酸∶水=2∶2∶1,顯色劑:濃度為10%(v/v)的乙醇-硫酸溶液。

質(zhì)譜(ESI-MS)分析[21]:寡糖樣品采用以電噴霧作離子源的質(zhì)譜儀在負(fù)離子模式下測(cè)定寡糖的相對(duì)分子質(zhì)量,1.0 mg/mL樣品溶于1∶1的乙腈/水,經(jīng)LC注射環(huán)直接進(jìn)樣5 μL,用Maslynk 4. 0軟件采集和處理數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以3次平行測(cè)定的均值表示,數(shù)據(jù)使用軟件SPSS 17.0進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物濃度對(duì)酶解過(guò)程的影響

分別測(cè)定不同底物濃度、不同時(shí)間下還原糖的生成量,考察卡拉膠酶水解過(guò)程中還原糖生成量的變化,結(jié)果如圖1所示。

圖1 底物濃度對(duì)卡拉膠酶解過(guò)程的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on the hydrolysis of carrageenan

由圖1可以看出當(dāng)?shù)孜餄舛刃∮?2 g/L時(shí),還原糖的生成量以及反應(yīng)速度隨著底物濃度的增加逐漸增大。這是因?yàn)樵诿笣舛纫欢ǖ那闆r下,當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí),酶能夠充分飽和地與底物接觸反應(yīng),隨著底物濃度的增加,酶與底物的接觸面積越來(lái)越大,反應(yīng)速度也越來(lái)越快,水解產(chǎn)物的生成量也越來(lái)越大,但由于受到底物濃度的限制,反應(yīng)產(chǎn)物的生成量達(dá)到一定量后不再增加。但當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定程度時(shí)酶與底物的接觸達(dá)到飽和,沒(méi)有多余的酶參與催化反應(yīng),因此反應(yīng)速度不再增加。另一方面,由于卡拉膠溶液存在一定的粘度,阻礙了酶與底物的接觸,尤其是在高濃度條件下,酶不易均勻擴(kuò)散到溶液中,從而降低反應(yīng)速度,延緩了酶解反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間。因此,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?4 g/L時(shí)與底物濃度為12 g/L時(shí)相比,還原糖的生成量相當(dāng)且不再顯著增加,即12 g/L為卡拉膠酶解反應(yīng)的最佳底物濃度。

2.2 pH對(duì)酶解過(guò)程的影響

溶液pH對(duì)酶解效果的影響較大,一般只有在最適pH條件下酶才表現(xiàn)出最強(qiáng)催化效率,過(guò)酸或過(guò)堿條件下,酶解效果會(huì)有所降低,甚至使酶失活。另一方面,卡拉膠的穩(wěn)定性對(duì)酶解反應(yīng)會(huì)存在影響,由于卡拉膠在酸性條件下不穩(wěn)定容易發(fā)生降解,而在中性和堿性條件下較穩(wěn)定,在pH為9時(shí)穩(wěn)定性最好[18,23]。按照1.3.2的實(shí)驗(yàn)方法,分別測(cè)定不同pH條件下卡拉膠酶解反應(yīng)的還原糖生成量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 pH對(duì)卡拉膠酶解反應(yīng)過(guò)程的影響Fig.2 Effect of pH on the hydrolysis of carrageenan

由圖2可知,當(dāng)pH為9.0時(shí)還原糖的生成量、反應(yīng)速率達(dá)到最大,反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間最短,因此確定pH9.0為卡拉膠酶的最適pH。在酸性條件下,還原糖的生成量明顯低于堿性條件,即卡拉膠酶在堿性條件下的酶解效果要明顯強(qiáng)于酸性條件下的酶解效果。根據(jù)pH6.5條件下還原糖生成量的變化趨勢(shì),推測(cè)在酸性條件下卡拉膠酶活力可能受到抑制。

2.3 溫度對(duì)酶解過(guò)程的影響

溫度一方面可以影響酶的催化特性,另一方面影響溶液的流變特性,從而影響酶解效果。在一定溫度范圍內(nèi),酶催化速率隨溫度的升高而升高,當(dāng)溫度升高到一定范圍時(shí),酶蛋白發(fā)生變性,減少有效酶量,導(dǎo)致降低酶促反應(yīng)速率,因此一般酶解反應(yīng)條件比較溫和。隨著溫度的升高,增加溶液中各成分的熱能,底物分子和酶運(yùn)動(dòng)加快,增加了兩者的接觸機(jī)會(huì),改變反應(yīng)平衡常數(shù),從而改變底物的生成量。

在不改變其他條件的情況下,在不同溫度下酶解反應(yīng)還原糖的生成量如圖3所示。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)酶解卡拉膠反應(yīng)過(guò)程的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the hydrolysis of carrageenan

由圖3可知,反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí)還原糖的生成量達(dá)到最大,且反應(yīng)速率最快,在35～50 ℃在反應(yīng)后期差異不大。當(dāng)溫度大于40 ℃時(shí),隨溫度的升高還原糖的生成量逐漸降低,因此確定卡拉膠酶解反應(yīng)的最適溫度為40 ℃。

對(duì)比35 ℃與55 ℃水解曲線(xiàn),在反應(yīng)初期酶解反應(yīng)速率基本相同,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)55 ℃條件下還原糖的生成量基本不再增加,由此反映出溫度相對(duì)較高的55 ℃條件下,酶逐漸失活。但由于酶蛋白的變性失活需要一定時(shí)間才能被表現(xiàn)出來(lái),因此在反應(yīng)初期酶依然能夠作用于卡拉膠生成部分還原糖。在60 ℃時(shí),反應(yīng)初期的速率相對(duì)較低,進(jìn)一步說(shuō)明了卡拉膠酶的高溫不耐受性。

2.4 振蕩速率對(duì)酶解過(guò)程的影響

在振蕩條件下,可能會(huì)增加酶與底物的接觸機(jī)會(huì),從而加快反應(yīng)的進(jìn)行。卡拉膠溶液具有較高的粘度,添加適當(dāng)?shù)恼袷?對(duì)反應(yīng)過(guò)程的傳質(zhì)、傳熱會(huì)產(chǎn)生有利的影響。考察不同振蕩速率下還原糖的生成量,結(jié)果如圖4所示。

圖4 振蕩速率對(duì)酶解卡拉膠反應(yīng)過(guò)程的影響Fig.4 Effect of oscillation rate on the hydrolysis of carrageenan

由圖4所示,振蕩速率為100 r/min的條件下,還原糖的生成量達(dá)到最大,振蕩速率過(guò)高或過(guò)低均不利于還原糖的生成。由此說(shuō)明適宜的振蕩環(huán)境有助于酶與底物的充分接觸,使酶促反應(yīng)的催化效率及底物轉(zhuǎn)化率更高、更徹底,但對(duì)比于其他因素條件(底物濃度、pH、反應(yīng)溫度)，振蕩速率對(duì)還原糖的改變量相對(duì)變化不大。

2.5 不同反應(yīng)溫度和pH條件下的平均聚合度

基于不同反應(yīng)溫度和不同pH條件下還原糖生成量的較大差異,將這兩種條件下的平均聚合度進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同反應(yīng)溫度(A)和不同pH(B)條件下的平均聚合度變化曲線(xiàn)Fig.5 Average polymerization degrees of reaction products under different temperature(A)and different pH(B)conditions

圖5A中隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行,在35～50 ℃范圍的平均聚合度的變化差異基本不大,不同溫度下平均聚合度范圍為7～14。由圖5B可明顯觀(guān)察到隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行,不同pH條件下平均聚合度變化差異較大,平均聚合度變化范圍為7～45,因此可主要通過(guò)改變pH控制反應(yīng)條件制得不同平均聚合度的卡拉膠寡糖。

2.6 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果及分析

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果在pH9.0,反應(yīng)溫度40 ℃,振蕩速率100 r/min條件下,分別測(cè)得不同底物濃度下的反應(yīng)初速度,以1/[S]為橫坐標(biāo),1/[V]為縱坐標(biāo)繪制底物濃度與反應(yīng)初速度的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)擬合曲線(xiàn),結(jié)果如圖6所示:

圖6 底物濃度與反應(yīng)初速度的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)擬合曲線(xiàn)Fig.6 Fit curve of Lineweaver-Burk plot between initial reaction rate and substrate concentration

由圖6可知在最適反應(yīng)條件下底物濃度與反應(yīng)初速度的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)擬合方程為:y=185.99x+1.0816,得卡拉膠酶的Km值為171.96 mg/mL,最大反應(yīng)速度Vmax為0.925 mg·mL-1·min-1。

2.7 最優(yōu)工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及20 L放大實(shí)驗(yàn)

在最佳酶解工藝條件下酶解反應(yīng)60 min,進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),并按照上述條件進(jìn)行20 L放大實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖7所示:

圖7 最優(yōu)工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(A)與20 L放大實(shí)驗(yàn)(B)水解曲線(xiàn)Fig.7 Verification test of optimum technology(A) and enlarging experiment of 20 L scale(B)

由圖7可知,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),還原糖的含量逐漸增加,并在20 min基本達(dá)到平衡。最優(yōu)工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和放大實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)一致。

2.8 水解產(chǎn)物的組成與結(jié)構(gòu)分析

2.8.1 薄層層析(TLC)檢測(cè) 在最優(yōu)條件下,對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間下的酶解產(chǎn)物,點(diǎn)樣上清液,采用TLC法進(jìn)行分析,結(jié)果如圖8所示。

圖8 TLC檢測(cè)不同時(shí)間下卡拉膠酶解反應(yīng)產(chǎn)物Fig.8 TLC analysis of the products of carrageenan enzymatic hydrolysis under different reaction time

根據(jù)TLC結(jié)果顯示,反應(yīng)0.5 h時(shí),酶解產(chǎn)物主要為六糖;反應(yīng)1、2 h可觀(guān)察到有四糖、六糖生成;在反應(yīng)6 h時(shí)除了四糖、六糖還可觀(guān)察到有二糖產(chǎn)生;在反應(yīng)12、24 h時(shí),產(chǎn)物主要為二糖、部分為四糖。由此說(shuō)明在最優(yōu)條件下短時(shí)間(0.5～2 h)內(nèi),酶解反應(yīng)的主要產(chǎn)物為四糖和六糖。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),反應(yīng)底物逐漸被降解分子量更小的六糖、四糖、二糖,還原糖的生成量也隨之逐漸增加。因此可以根據(jù)需要調(diào)整酶解反應(yīng)時(shí)間,制備適合的卡拉膠寡糖。

2.8.2 質(zhì)譜(ESI-MS)分析 根據(jù)TLC分析結(jié)果,對(duì)酶解24 h的產(chǎn)物進(jìn)行醇沉分級(jí),直接通過(guò)MS分析酶解產(chǎn)物分子量。

根據(jù)TLC分析結(jié)果,對(duì)酶解24 h的產(chǎn)物進(jìn)行醇沉分級(jí),直接通過(guò)MS分析酶解產(chǎn)物分子量。由圖9中可看出質(zhì)譜圖上形成兩個(gè)主要的峰,對(duì)應(yīng)的質(zhì)核比分別為394.0和403.0,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[18]及質(zhì)譜結(jié)果可知質(zhì)核比394.0、403.0、709.0、789.0分別對(duì)應(yīng)[(An-G4S)]2-、[(An-G4S)]-、[(An-G4S)2]-和[(An-G4S)(An-G)]-,表明酶解主產(chǎn)物為κ-卡拉膠二糖,即均含有1個(gè)3,6-內(nèi)醚-α-D-半乳糖殘基和1個(gè)4-硫酸-β-D半乳糖殘基。結(jié)合TLC結(jié)果與質(zhì)譜結(jié)果共同驗(yàn)證,酶解反應(yīng)終產(chǎn)物為卡拉膠二糖。因此可得出隨著水解時(shí)間的推移,卡拉膠依次被分解成小分子量的κ-卡拉膠六糖、四糖、二糖,而酶解反應(yīng)終產(chǎn)物為κ-卡拉膠二糖。

圖9 卡拉膠酶解產(chǎn)物ESI-MS譜圖Fig.9 ESI-MS spectrum of the enzymatic hydrolysis products of carrageenan

3 結(jié)論

本研究利用食鹿角菜假交替單胞菌ASY5發(fā)酵生產(chǎn)κ-卡拉膠酶酶解κ-卡拉膠制備κ-卡拉膠寡糖,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了較佳反應(yīng)條件為:底物濃度12 g/L、pH9.0、反應(yīng)溫度40 ℃、振蕩速率100 r/min。在該條件下還原糖生成量可達(dá)1.61 mg/mL,在不同pH條件下可制得平均聚合度范圍為7～45的卡拉膠寡糖。結(jié)合TLC和質(zhì)譜方法對(duì)κ-卡拉膠寡糖的組成和結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明酶解反應(yīng)終產(chǎn)物為κ-卡拉膠二糖。相對(duì)于傳統(tǒng)酶解卡拉膠制備卡拉膠寡糖的方法,本研究為改進(jìn)κ-卡拉膠寡糖的制備工藝從而提高卡拉膠寡糖的得率提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Technology optimization for enzymatic preparation of κ-carrageenan oligosaccharides

ZHANG Xue-fang1,YU Qian1,WU Chang-zheng1,2,3,4, XIAO Qiong1,2,3,4,ZHU Yan-bing1,2,3,4,XIAO An-feng1,2,3,4,*

(1.College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China; 2.Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering of Fujian Province,Xiamen 361021,China; 3.Fujian Provincial Engineering Technology Research Center of Marine Functional Food,Xiamen 361021,China; 4. Xiamen Key Laboratory of Marine Functional Food,Xiamen 361021,China)

In this study,κ-carrageenan oligosaccharides were prepared by enzymatic hyrolysis method to improve the technology. Hydrolysis conditions were optimized with the characteristic signs of reducing sugars content,and the optimal conditions for κ-carrageenan oligosaccharides preparation were obtained as substrate concentration 12 g/L,pH7.0,reaction temperature 40 ℃ and shaking speed 100 r/min,respectively. Compared with the reducing sugars yield of the initial conditions,the yield of the optimal conditions increased from 0.91 mg/mL to 1.61 mg/mL,which was increased by 77%. The Kmand Vmaxvalues of the enzyme hydrolysis reaction was 171.96 mg/mL and 0.925 mg·mL-1·min-1,respectively. Then,the result of optimal process validation test could consistent with that of 20 L enlarge experiment. At last,the enzymatic hydrolysis products were analyzed by thin-layer chromatography and mass spectrometry,the result showed that the main products included tetrasaccharide and hexasaccharides in 24 h reaction.

carrageenan;carrageenan oligosaccharides,;enzymolysis

2016-07-28

張雪芳(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：1546095135@qq.com。

*通訊作者:肖安風(fēng)(1973-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：xxaaffeng@jmu.edu.cn。

福建省高校產(chǎn)學(xué)合作項(xiàng)目(2016N5008)；福建省科技重大專(zhuān)項(xiàng)/專(zhuān)題(2015NZ0001-1)；福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(閩海洋高新[2016]08號(hào))；國(guó)家海洋公益行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201505033)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0171-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.025