普洱茶發酵產茶多糖菌株的篩選與鑒定

王洪振,馬存強,2,任小盈,王 潘,周斌星,3,*

(1.云南農業大學龍潤普洱茶學院,云南昆明 650201; 2.昆明大樸茶業有限公司,云南昆明 650224; 3.安徽農業大學茶與食品科技學院,安徽合肥 230036)

普洱茶發酵產茶多糖菌株的篩選與鑒定

王洪振1,馬存強1,2,任小盈1,王 潘1,周斌星1,3,*

(1.云南農業大學龍潤普洱茶學院,云南昆明 650201; 2.昆明大樸茶業有限公司,云南昆明 650224; 3.安徽農業大學茶與食品科技學院,安徽合肥 230036)

以不同階段的普洱茶發酵樣為實驗材料進行真菌的分離純化,將分離純化出的優勢真菌在理想條件下和自然狀態下分別進行茶葉接種發酵,篩選出產茶多糖的優勢菌。結果表明,在普洱渥堆發酵中共分離純化出22株菌株,其中5株菌株在渥堆發酵的不同階段頻繁檢出,可用于接種發酵實驗。在接種發酵中,茶多糖均有顯著增加(p<0.05)。其中PEZJ-1菌株提高茶多糖含量最為顯著,在理想條件下和自然狀態下的接種發酵中茶多糖含量分別達到23.57%和27.85%。通過菌落形態、分生孢子顯微特征、18S rDNA序列,對PEZJ-1進行鑒定,確定該菌株為Aspergillusniger(GenBank登錄號為JX863374),屬于曲霉屬。在普洱茶渥堆發酵中接種外源微生物能顯著提高茶多糖含量,Aspergillusniger能大幅度提高茶多糖含量,為茶多糖的開發應用提供了微生物菌種。

茶多糖,普洱茶,篩選,鑒定,黑曲霉

茶葉中的糖類物質主要包括單糖、寡糖、多糖及少量其它糖類。茶多糖(tea polysaccharides)是一類從茶葉中分離出溶于水的具有生理活性的糖蛋白[1]。現代醫學研究表明茶多糖具有降血糖[2-4]、降血脂[5-6]、降血壓[7]等多種保健功效,并對肺癌細胞增殖有一定抑制作用[8],是一種具有廣闊開發前景的天然藥物。

普洱茶是以云南大葉種茶樹鮮葉[Camelliasinensis(Linn)var.assamica(MastersKitamura)]加工而成的曬青毛茶為原料,采取特定的加工工藝,形成具有獨特品質特征的茶葉[9]。按照加工工藝不同分為普洱茶(生茶)和普洱茶(熟茶)。普洱茶(熟茶)具有減少腰部脂肪堆積[10]、抗菌[11-12]、抗氧化[13]、減少動脈粥樣硬化幾率[14]和一定的防癌抗癌作用[15-16]功效。渥堆(固態發酵)是普洱茶(熟茶)品質形成的關鍵工序。在普洱茶渥堆過程中分離鑒定出多種微生物,其中包括真菌[17-18]、細菌[17]、嗜熱菌[19]等。真菌主要以曲霉菌、酵母菌、青霉菌和根霉菌為主[20],它們對普洱茶(熟茶)品質形成以及物質變化起主要作用。

普洱茶多糖是指從普洱茶中分離純化出的茶多糖。郭威等[21-22]研究證實普洱茶多糖共有TPS1、TPS2、TPS3、TPS4四種組分,含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖8種單糖。在渥堆發酵過程中,真菌、細菌、嗜熱菌的繁殖代謝對茶多糖的含量、構成、分子量大小產生深刻影響。本文以普洱茶渥堆發酵樣為材料,篩選鑒定出在渥堆發酵過程中可顯著增加茶多糖含量的菌株,為未來開發普洱茶多糖提供優良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普洱茶渥堆發酵樣和云南大葉種曬青毛茶 昆明大樸茶業有限公司。普洱茶自然渥堆與單一微生物接種渥堆發酵在昆明大樸茶廠完成。

Labonce-150TH恒溫恒濕培養箱 北京蘭貝石恒溫技術有限公司;Agilent1200型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;JH-752型紫外可見分光亮度計 上海菁華科技儀器有限公司;SW-CJ-ID型單人凈化工作臺。

1.2 實驗方法

1.2.1 無菌與傳統渥堆發酵處理 無菌發酵處理:稱取潮水量為38%的云南大葉種曬青毛茶,高壓滅菌鍋內121 ℃滅菌15 min,冷卻至室溫后,放置于恒溫恒濕培養箱(27 ℃,85%)內進行無菌發酵,每隔5 d取樣一次,測定其含水量,并提取茶多糖。傳統渥堆處理:準確稱取200 kg云南大葉種曬青毛茶添加適量生活飲用水,使曬青毛茶潮水量維持在38%～45%之間,在自然狀態下進行傳統渥堆,每隔5 d取樣一次,測定其含水量,提取茶多糖。

1.2.2 普洱茶渥堆過程中真菌的分離純化 無菌操作稱取不同渥堆階段茶樣1.000 g,加入9 mL無菌生理鹽水,并依次稀釋級數為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5,用PDA培養基進行基內接種,采用稀釋涂布法,每個稀釋度做3個平行、兩次重復,27 ℃倒置培養。培養3 d后,每日觀察并記錄各個菌株生長的顏色、形態、大小及質地的變化。通過以上的觀察記錄,對菌株進行形態鑒定。

1.2.3 單一微生物發酵樣的制備 稱取20 g曬青毛茶與12.25 mL蒸餾水混合,高溫高壓滅菌后,每培養瓶接種1 mL目標菌株的種子液。培養瓶均放置于恒溫恒濕培養箱內(30 ℃,85%)進行茶葉發酵。每隔5 d取樣一次,測定其含水量和茶多糖。

1.2.4 單一微生物菌粉的制備和自然條件下單一微生物渥堆發酵 菌粉的制備:采用200 g大米、20 g葡萄糖、200 mL蒸餾水的常規真菌種子培養基,分別接種優勢菌的孢子菌懸液,在恒溫恒濕培養箱(27 ℃,85%)內培養至菌落成熟后,在55 ℃恒溫下干燥,在無菌條件下于研磨成粉狀。自然條件下單一微生物接種渥堆發酵:設置相同潮水量的50 kg曬青毛茶發酵堆,在紫外線輻射滅菌處理后,分別接種0.1%的優勢菌菌粉,在自然條件下進行渥堆發酵,每隔5 d取樣一次。

1.2.5 化學成分測定 水分測定采取GBT 8304-2013中120 ℃烘干法(快速法)測定。

茶多糖提取與測定[22]粉碎(過40目篩)→稱樣→加蒸餾水→浸提→過濾→濃縮→乙醇沉淀→靜置→離心(4000 r/min)→無水乙醇、丙酮、乙醚重復洗滌三次→干燥→茶多糖成品。茶多糖含量采取苯酚-硫酸法比色測定[23]。

1.2.6 優勢菌株的鑒定 菌落及菌株形態觀察:無菌操作接種在PDA和察氏培養基上7 d后觀察菌落形態。并在顯微鏡下觀察細胞形態。分子鑒定方法如下:

DNA提取:目標菌株分別接種至PDA培養基以及察氏固態培養基,27 ℃培養觀察菌落生長狀況,并在高倍顯微鏡觀察菌株形態特征。并將目標菌株接種至察氏(CYA)液態培養基中培養、收集菌絲體、-80 ℃冷凍干燥后采取真菌DNA提取試劑盒法提取DNA。

PCR擴增:ITS序列通過引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行擴增。PCR反應程序為:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min;54 ℃退火1 min;72 ℃延伸1.5 min;共35個循環;72 ℃延伸10 min.程序結束后進入10 ℃狀態。

rDNA序列分析:對PCR產物通過DNA自動測序儀進行測序,并將所獲序列提交到NCBI的Genbank數據庫進行同源序列搜索,并調出相關菌株ITS1-5.8S-ITS2 rRNA基因序列,用ClustalX1.8軟件進行多序列比對,通過MEGA4軟件選用Kimura2-parameter距離模型計算進化距離,用Nerghbor-Joining 法構建系統發育樹,1000次隨機抽樣計算Bootstrap值以評估系統發育的置信度。

1.3 數據統計與分析

數據分析采用SPSS 20.0軟件。數值表示為平均值±S.D.并通過單因素方法(one-way ANOVA)分析不同樣品之間差異的顯著性(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 無菌發酵與傳統渥堆發酵茶多糖含量的變化

在普洱茶(熟茶)發酵渥堆中,微生物對茶多酚、茶色素、氨基酸、游離總糖[17]均有顯著影響。本文以云南大葉種曬青毛茶為原料,分別進行的無菌處理和傳統渥堆發酵,并測定不同發酵階段茶樣中茶多糖含量(圖1)。在無菌發酵中,茶多糖含量基本穩定在9.13%～11.22%之間。在普洱茶傳統的渥堆發酵中,茶多糖呈現先增加后減少的變化趨勢;在發酵第10 d,含量達到最大,與原料相比,茶多糖增加了67%左右。通過無菌處理作為對照,可知在普洱茶渥堆發酵中,微生物可顯著提高茶多糖含量。研究人員[24]在普洱茶渥堆過程中共分離出40余種真菌,分屬于19個不同的屬,其中曲霉屬、青霉屬、酵母菌屬占普洱茶菌落的80%左右[25]。在普洱茶渥堆發酵中可顯著提高茶多糖含量的優勢菌值得進一步研究。

圖1 無菌發酵與傳統渥堆發酵過程中茶多糖的含量變化Fig.1 The variation of tea polysaccharides in sterile and traditional fermentation

2.2 普洱茶渥堆發酵樣中分離純化出的真菌

以不同發酵階段的普洱茶渥堆樣(共21個)為材料,對普洱茶渥堆發酵中真菌進行分離純化,并統計不同菌株出現的頻率。如表1所示,共計22種。其中PEZJ-1,PEZJ-5,PEZJ-8,PEZJ-9,PEZJ-10為普洱茶渥堆發酵的優勢菌,在不同階段的普洱茶發酵樣中經常反復出現,并可將單菌種接種至茶葉中進行茶葉微生物發酵。其他菌株僅在普洱茶渥堆發酵的某一階段檢出或在某個渥堆發酵樣中偶爾檢出,且單菌種接種至茶葉中不存活或不引起茶葉的顯著變化。因此,以PEZJ-1,PEZJ-5,PEZJ-8,PEZJ-9,PEZJ-10為普洱茶渥堆發酵的優勢菌篩選出可增加茶多糖含量的優勢菌。

表1 不同微生物形態特征描述Table 1 The description of different microorganism characteristics

2.3 優勢菌單菌種發酵對茶多糖含量的影響

在實驗室的無菌條件下接種單菌種,茶多糖的變化趨勢如圖2所示。在單菌種茶葉發酵前期,茶多糖含量均顯著性增加。這與微生物對纖維素的分解代謝有關。在發酵后期,由于微生物對茶多糖代謝的差異,茶多糖的保留量明顯不同。在PEZJ-5,PEZJ-9的單菌種茶葉發酵中,茶多糖整體無顯著性變化。在PEZJ-1的單菌種茶葉發酵中,茶多糖含量持續上升,在發酵第35 d達到最大,為23.57%±0.7%,是原料的2.58倍。PEZJ-1可能為增加茶多糖含量的優勢菌。茶多糖的大幅度增加與該菌對茶多糖的利用有限有關。

圖2 茶葉單菌種發酵過程中茶多糖含量的變化Fig.2 The variation of tea polysaccharides in tea fermentation by single strain

2.4 自然狀態優勢菌接種發酵對茶多糖含量的影響

為了探究在自然狀態下,微生物對茶多糖含量的影響,篩選出可應用于生產中的產茶多糖菌株,5株菌株的菌粉按照一定比例分別添加到云南大葉種曬青毛茶進行自然潮水渥堆發酵,并測定不同階段茶多糖含量。不同菌株茶葉發酵中茶多糖含量如圖3所示。在自然條件下,五株菌株的接種發酵實驗中,茶多糖的變化規律與實驗室條件下單菌種茶葉發酵基本一致。整體上,PEZJ-5,PEZJ-9對茶多糖含量影響不大;在發酵末期,茶多糖含量較原料有所下降,降幅分別為17.7%和4.8%。PEZJ-1,PEZJ-8和PEZJ-10均能顯著提高茶多糖含量。在PEZJ-8和PEZJ-10的自然接種發酵實驗中,茶多糖呈現先增加后減少的變化趨勢;在發酵結束時,茶多糖含量較原料分別增加73.8%和48.9%。在PEZJ-1發酵過程中茶多糖含量持續上升。在發酵第35d后,茶多糖含量達到最大,為27.85%±0.5%,為原料的2.21倍。因此斷定PEZJ-1為普洱茶發酵中產茶多糖的優勢菌株。

圖3 自然狀態下茶葉接種發酵過程中茶多糖含量變化Fig.3 The variation of tea polysaccharides during tea inoculated fermentation under natural conditions

2.5 優勢菌株的鑒定結果

PEZJ-1在PDA培養基和察氏培養基上菌落形態特征如圖4所示。PEZJ-1在PDA培養基上菌落直徑3.4 cm,黑色粉狀,扁平,邊緣白色整齊,氣生菌絲稀少;菌落背面乳白夾黑色。PEZJ-1在察氏培養基上菌落直徑達3.2cm,白色至棕黑色,扁平,絨粉狀邊緣整齊,有放射狀溝紋,中間有粉紅色顆粒狀菌核;菌落背面淺棕褐色,有曲線狀放射溝紋。PEZJ-1的分生孢子形態特征如圖5所示。PEZJ-1菌株的菌絲發達多分枝、有隔膜多核;分生孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌絲細胞(足細胞)上垂直生出,頂部形成球形頂囊,其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗,小梗上長有成串褐黑色的球狀分生孢子,粗糙,直徑3.0～4.75 μm;分生孢子頭球狀如“菊花”,呈褐黑色直徑700～800 μm。

圖4 PEZJ-1菌株在培養基上的菌落形態Fig.4 Colony morphology of PEZJ-1 strain on culture medium 注:a為PDA培養基正面,b為PDA培養基背面,c為察氏培養基正面,d為察氏培養基背面。

圖5 PEZJ-1在電子顯微鏡下的形態特征Fig.5 Morphological characteristics of PEZJ-1 under transmission electron microscope

對PCR產物通過DNA自動測序儀進行測序,測序結果并將所獲序列提交到NCBI的Genbank數據庫進行同源序列搜索,并調出相關菌株ITS1-5.8S-ITS2 rRNA基因序列(圖6)。通過在線Blast比對檢索,目標菌株屬于曲霉屬,與菌株AspergillusnigerNCBT110A相似性為99.8%。通過系統進化樹(圖7),結合其菌落形態特征和顯微形態觀察,將目標菌株鑒定為:黑曲霉(Aspergillusniger)。

圖7 系統進化樹Fig.7 Phylogenetic tree

圖6 ITS1-5.8S-ITS2 rRNA序列Fig.6 The sequences of ITS1-5.8S-ITS2 rRNA

3 結論與討論

在普洱茶傳統渥堆發酵過程中,由于微生物的參與,茶多糖含量有一定程度的增加。本文以理想條件下的滅菌處理作為對比,推斷出茶多糖的增加與普洱茶渥堆中微生物的參與,特別是種類繁多、代謝旺盛的真菌密切有關。

本研究以不同階段的普洱茶渥堆發酵樣為實驗材料,通過PDA培養基對普洱茶渥堆發酵中出現的真菌進行分離純化,共分離純化出22株真菌。大多數菌株僅在發酵的某一階段或某一個發酵樣中偶爾檢出。而PEZJ-1、PEZJ-5、PEZJ-8、PEZJ-9、PEZJ-10等5株真菌在不同階段普洱茶渥堆發酵樣中頻繁檢出,且能單菌種接種至茶葉使茶葉形態發生深刻變化。因此,以此5株真菌為實驗菌株,通過單菌種發酵和接種發酵,篩選可增加茶多糖含量的優勢菌株。并根據菌落特征、分生孢子結構、DNA序列,對優勢菌進行鑒定。

在5種菌株中,PEZJ-5,PEZJ-9整體上對茶多糖無顯著影響,PEZJ-1、PEZJ-8、EZJ-10等3種菌株在理想條件下的單菌種發酵和自然狀態下的接種發酵中均能顯著提高茶多糖。特別是PEZJ-1能大幅度提高茶多糖含量,在單菌種發酵與接種發酵中,茶多糖含量分別為23.57%和27.85%,與原料相比,茶多糖增幅分別為158%和121%,為普洱茶渥堆發酵中可增加茶多糖含量的優勢菌株。通過菌落形態觀察、分生孢子顯微特征分析以及18S rDNA測序鑒定PEZJ-1菌株為黑曲霉(Aspergillusniger),為茶多糖保健品的開發提供一定參考。

[1]宛曉春.茶葉生物化學(第三版)[M].北京:中國農業出版社,2007:54-55,340-344,419-420.

[2]楊軍國,陳泉賓,王秀萍,等.茶多糖組成結構及其降血糖作用研究進展[J].福建農業學報,2014,29(12):1260-1264.

[3]Chen X,Wang Y,Wu Y，et al. Green tea polysaccharide conjugates protect human umbilical vein endothelial cells against impairments triggered by high glucose[J].International Journal of Biological Macromolecules,2011,49(1):50-54.

[4]俞東寧,陳萍,王爽,等.龍井茶多糖對ALX糖尿病模型小鼠氧化應激的影響[J].中國食品學報,2016,16(4):30-34.

[5]潘見,陳彥,方偉,等.具有抗氧化活性茶多糖TPS-Ⅱ的分離純化及其性質研究[J].食品科學,2009(3):25-28.

[6]王媛,榮華,初曉輝,等.普洱茶提取物及普洱茶多糖對人成纖維細胞抗衰老作用機制研究[J].云南農業大學學報,2015,30(2):219-227.

[7]Yang Jianjun,Chen Bin,Gu Yan. Pharmacological evaluation of tea polysaccharides with antioxidant activity in gastric cancer mice[J]. Carbohydrate Polymers,2012,90:943-947.

[8]魏楠,朱強強,陳標名,等.茶多糖對阿霉素抑制肺癌A549細胞增殖作用的影響[J]. 茶葉科學,2016,36(5):477-483.

[9]蔡新,張理珉,楊善禧,等.GB/T 22111-2008,地理標志產品 普洱茶[S]. 北京:中國標準出版社,2008.

[10]Kazumitsu Kubota,Shunichiro Sumi,Hideaki Tojo,et al.Improvements of mean body mass index and body weight in preobese and overweight Japanse adults with balck Chinese tea(pu-erh)water extract[J].Nutrition Research,2011,31:421-428.

[11]Hu Yongjin,Jia Junjing,Qiao Jinling,et al.Antimicrobial activity of pu-erh tea extractsinvitroand its effects on the preservation of cooled mutton[J]. Journal of Food safety,2010,30:177-195.

[12]Su Yajuan,Zhang Chenlu,Wang Yan,et al. Antibacterial property and mechanism of a novel Pu-erh tea nanofibrous membrane[J]. Appl. Microbiol Biotechnol,2012,93:1663-1671.

[13]Gong Jia-Shun,Peng Chun-Xiu,He Xiang,et al. Antioxidant activity of extracts of pu-erh tea and its material[J]. Asian Journal of Agricultural Sciences,2009,1(2):48-54.

[14]Hou Yan,Shao Wanfang,Xiao Rong,et al. Pu-erh tea aqueous extracts lower atherosclerotic risk factors in a rat hyperlipidemia model[J]. Experimental Gerontlogy,2009,44:434-439.

[15]Zhao Hang,Zhang Min,Zhao Lu,et al.Chang of constituents and activity to apoptosis and cell cycle during fermentation of tea[J].International Journal of Molecular Sciences,2011,12:1862-1875.

[16]Way Tzong-Der,Lin Hui-Yi,Kuo Daih-Huang,et al. Pu-erh tea attenuates hyperlipogenesis and induces hepatoma cells growth arrest through activating AMP-Activatd Protein Kinase(AMPK)in human HepG2 cells[J].J Agric. Food Chem,2009,57:5257-5264.

[17]Lv Hai-peng,Zhang Ying-jun,Lin Zhi,et al.Processing and chemical constituents of pu-erh tea[J].Food research international,2013,53:608-618.

[18]Wang Qiu-ping,Gong Jia-shun,Chisti Yusuf,et al.Fungal isolates from a pu-erh type tea fermentation and their ability to convert tea polyphenols to theabrownins[J]. Journal of food science,2015,80:809-817.

[19]楊瑞娟,呂杰,嚴亮,等. 普洱茶渥堆發酵中嗜熱真菌的分離和鑒定[J]. 茶葉科學,2011,31(4):371-378.

[20]Qin Jin-Hua,Li Ning,Tu Peng-Fei,et al. Change in Tea Polyphenol and Purine Alkaloid Composition during Solid-State Fungal Fermentation of Postfermented Tea[J]. J. Agric.Food Chem. 2012,60:1213-1217.

[21]Guo Wei,Zhou Bin-xing,Luo Ling,et al. Analysis of Monosaccharide Composition of Puerh Tea Polysaccaride by Precolumn Derivatization HPLC[J].Agricultural Science & Technology,2013,04:556-558,572.

[22]羅玲,周斌星,郭威,等.普洱茶茶多糖的提取工藝的響應面分析研究[J].中國農學通報,2012,30:263-266.

[23]楊軍國,陳鍵,王麗麗,等.醇沉分級粗茶多糖的抗氧化活性比較及變化機制[J].食品工業科技,2016,(17):96-100.

[24]Zhao Z.J,Tong HR,Zhou L,et al.Fungal colonization of pu-erh tea in Yunnan[J].Journal of Food Safety,2010,30:769-784.

[25]趙振軍,童華榮,周黎,等. 普洱茶中真菌種群的分離與分子鑒定[J]. 茶葉科學,2009,29(6):436-442.

Screening and identification of a strain capable of producing tea polysaccharide from pu-erh tea fermentation

WANG Hong-zhen1,MA Cun-qiang1,2,REN Xiao-ying2,WANG Pan1,ZHOU Bin-xing1,3,*

(1.LongRun Pu-erh Tea College,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China; 2.Kunming Dapu Tea Industry Co.,Kunming 650224,China; 3.College of Tea and Food Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)

With samples from different stages of pu-erh tea fermentation as experimental material,fungi were isolated and purified. The isolated strains were conducted tea single strain fermentation under ideal condition and inoculated fermentation to screen out a dominant strain capable of increasing tea polysaccharides.The results showed that 22 strains were isolated and purified from pu-erh tea solid-state fermentation,5 dominant strain used in inoculated fermentation were high frequency in pu-erh tea.During the fermentation by isolated strains,tea polysaccharides increased significantly(p<0.05). Especially in fermentation inoculated by PEZJ-1,tea polysaccharides increased most obviously and reached 23.57% and 27.85% under ideal condition and inoculated fermentation,respectively. Based on the colonial morphology,conidium microscopic characteristics and 18S rDNA gene sequence,the strain of PEZJ-1 was identified asAspergillusniger. Therefore,in pu-erh tea solid-state fermentation,exogenous inoculation could improve tea polysaccharides significantly. AndAspergillusnigerenhanced tea polysaccharides by a wide margin,which provides the microbial strain for the development of tea polysaccharides.

tea polysaccharides;pu-erh tea;screening;identification;Aspergillusniger

2016-09-06

王洪振(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：茶葉加工與綜合利用，E-mail：1711842897@qq.com。

*通訊作者:周斌星(1963-)，男，博士，副教授，研究方向：茶葉加工，E-mail：bxzhou01@126.com。

紫鵑茶樹調控花色苷生物合成的MBW轉錄因子復合體研究(C161104);保山市名優綠茶加工工藝研制開發。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0156-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.022