皮狀絲孢酵母產油脂的研究

柳 夢,鄭 操,田 華,付 杰,陳 濤,何東平,*

(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023; 2.中國科學院武漢病毒研究所,湖北武漢 430071)

皮狀絲孢酵母產油脂的研究

柳 夢1,鄭 操1,田 華1,付 杰1,陳 濤2,何東平1,*

(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023; 2.中國科學院武漢病毒研究所,湖北武漢 430071)

本文對皮狀絲孢酵母的生長發育和油脂合成進行了研究,監測和分析了酵母菌生長發育、油脂合成和脂肪酸成分及數量,檢測了形態、OD值、糖氮代謝、pH、生物量、油脂含量和脂肪酸組分。結果表明:皮狀絲孢酵母生長80 h左右時鏡檢測得菌細胞體內含油脂情況與80 h左右時實際提油獲得的油脂量相一致,其油脂產量為3.66 g/L,含油率約為39.20%。皮狀絲孢酵母生長0～6 h為適應期,此時糖氮的消耗明顯,細胞數量緩慢增加;6～25 h為對數期,氮消耗非常顯著,細胞數量急劇增加,細胞變大;25～120 h為穩定期,糖的消耗明顯,消耗速度顯然大于氮的消耗,細胞內開始慢慢積累油脂;之后為衰退期,氮的消耗基本趨于平穩。皮狀絲孢酵母所產脂肪酸主要以C16、C18為主,此類脂肪酸適于進行脂交換制備生物柴油。

皮狀絲孢酵母,脂肪酸成分分析,糖氮代謝

能源安全問題在國際上一直是個被高度重視的問題。隨著石油資源逐漸減少以及石油燃燒產生的廢氣對環境生態的巨大影響,而帶來的霧霾、二氧化碳增多使全球變暖等問題,促進了各國科學家企業家尋求新的能源,其中包括風能、日光能和生物柴油[1-2]。

生物柴油是一種由甘油三酯與乙醇通過甲基化得到的生物燃料,具有含硫物質和含芳香性物質量低、燃燒性能優良及生物可降解性等優點[3-4]。含有甘油三酯的油脂包括大豆油、棕櫚油、菜籽油、烏桕油、襐籽油等植物油脂和豬油、牛油、羊油等動物油脂以及餐飲廢棄油脂(地溝油)等[5]。

目前,用植物油脂和動物油脂來制備生物柴油已不能完全滿足人們生活生產的需求,因此對微生物油脂這一新油脂資源的開發和研究越來越受到人們的關注[6-9]。微生物油脂又稱單細胞油脂,是由細菌、酵母菌、絲狀真菌和海洋微藻等微生物產生的油脂。它們利用碳源(糖)、氮源(蛋白質)以及微量元素(鈉、鐵等)等營養物質,在一定的條件下生長發育產生大量的菌(藻)體,同時進行合成油脂而積累于細胞內。然后收集菌(藻)體,提取油脂。微生物油脂是含有甘油三酯的脂肪酸,包括棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸(GLA、ALA)、花生四烯酸(ARA)和二十二碳六烯酸(DHA)等,其中一部分可作為人體的營養因子如ARA、DHA等,一部分可作為生物柴油的原料如棕櫚酸、硬脂酸等。目前,主要集中在酵母菌和微藻產生油脂的研究[10-11]。皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)是一株高產油脂的菌株,其生長發育不受場地、季節等限制,發酵周期短[12-14],且所產脂肪酸成分與植物油脂脂肪酸成分相似,能為企業節約生產成本。

目前,國內外對皮狀絲孢酵母產油脂的研究較少。本文選取皮狀絲孢酵母作為研究對象,并對其生長發育和油脂的合成進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum) 編號GIM2.68,廣東省微生物菌種保藏中心;種子培養基組成(g/L) 蛋白胨5、葡萄糖10、酵母粉3、麥芽提取物3;發酵培養基組成(g/L) 蛋白胨15、葡萄糖80、酵母粉3、麥芽提取物3、金屬離子混合物0.01,維生素混合物0.03。

葡萄糖(分析純)，氫氧化鉀 天津市博迪化工股份有限公司;酵母粉 北京奧博星生物技術有限公司;麥芽提取物、正己烷(色譜級)、乙醚、石油醚、鹽酸、甘油、50%三氯化硼 天津市科密歐化學試劑有限公司;蒸餾水,甲醇 天津市東麗區泰蘭德化學試劑有限公司;無水乙醇 天津凱通化學試劑有限公司。

SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;YM75立式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫療器械有限公司;RE-52C旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;TDL-5-A臺式低速離心機 上海安亭科學儀器廠;AUY120電子天平 島津國際貿易(上海)有限公司;HYQ-150S全溫搖床 武漢匯誠生物科技有限公司;XSP-BM-2CA生物顯微鏡 上海上光新光學科學有限公司;GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱、SPX-150C恒溫恒濕箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;BCD-197VCZ 冰箱 河南新飛電器有限公司;XB-K-25血球計數板 鹽城市榮康玻璃儀器有限公司;安捷倫7890A-5975C氣質色譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司;色譜柱:SP-2560(100 m×25 μm×0.2 μm);紫外可見分光光度計 上海美譜達UV-3100PC)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 將凍干的菌粉用液體培養基制成懸浮液,吸取懸浮液100 μL涂布與平板上。涂布完畢將平板置于恒溫培養箱,在(28±2) ℃培養17 h轉接到另一個平板上,依次傳五代,獲得菌種。

1.2.2 種子培養 從活化好的平板中挑取較大的單菌落接種到含有5 mL液體培養基的安瓿瓶中,置于搖床中固定好,在(28±2) ℃、180 r/min條件下培養17 h,取樣檢查。

1.2.3 發酵培養 將培養處于對數期的菌種子液接種于發酵搖瓶中,在(28±2) ℃、180 r/min條件下培養120 h,每隔24 h取樣。用40倍高倍物鏡觀察皮狀絲孢酵母發酵過程中生長形態的變化,并拍照片。

1.2.4 生長曲線測定 從種子液培養開始,每2 h從搖瓶中取100 μL菌液到96微孔板中,在紫外分光光度計600 nm波長下測定菌液的吸光度,并作好記錄。菌液的吸光度可代表菌體的生長情況。

1.2.5 發酵過程中糖、氮代謝的測定 糖含量的測定采用蒽酮-硫酸法測定總糖[15],氮含量的測定采用凱氏定氮法[16]。

1.2.6 發酵過程中pH的測定 從加入發酵瓶開始,每隔5 h測一次取少量發酵液用pH計測發酵液的pH,并做好記錄。

1.2.7 生物量的測定 分別取70、80、90、100、110、120 h的發酵液1 L于燒杯中,分別標記為1、2、3、4、5、6,在4000 r/min下離心,洗滌三次。收集菌泥置于稱量好(記作M1,單位為g)的燒杯中,35 ℃干燥至恒重,稱取重量(記作M2,單位為g)。

生物量的計算公式:

式(1)

1.2.8 油脂的提取 將1.2.7中菌粉按照每克8 mL鹽酸(6 mol)的比例加入鹽酸,振蕩混勻室溫靜置1 h后,沸水浴中加熱8 min,立即放入-20 ℃冰箱中冷凍30 min。此操作重復五次。用高倍顯微鏡涂片檢測是否破壁完全。若破壁不完全,則繼續重復上述操作直至破壁完全[17]。細胞破壁完全后,將菌液倒入分液漏斗中,按照20 mL/g無水乙醇、24 mL/g已醚、24 mL/g石油醚的順序往分液漏斗中添加。搖勻靜置一段時間后取上清液放在稱量好重量(記作M3,單位為g)的旋蒸瓶中,60 ℃旋轉蒸發,直至有機溶劑全部蒸發完畢旋蒸瓶內重量達到恒重,稱取重量(記作M4,單位為g)。

油脂產量及含油率的計算公式:

油脂重量(g)=M4-M3

式(2)

式(3)

式(4)

1.2.9 脂肪酸成分測定

1.2.9.1 樣品前處理 在樣品中加入0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液1 mL,在60 ℃水浴鍋內加熱30 min,加熱過程中不斷振蕩。然后50%三氟化硼-甲醇溶液1 mL,在60 ℃水浴鍋內邊振蕩邊加熱30 min。加熱完畢后加入5 mL正己烷混勻,靜置后取上清液過濾,過濾好后注入進樣瓶中,待測。

1.2.9.2 檢測條件 升溫程序:140 ℃保持1 min,以5 ℃/min升溫至190 ℃,然后3 ℃/min升溫至220 ℃保持2 min。載氣(N2)流速25 mL/min,壓力2.4 kPa,進樣量1.8 μL,不分流[18]。

2 結果與分析

2.1 皮狀絲孢酵母油脂積累

圖1顯示了皮狀絲孢酵母四個不同時期顯微鏡下的形態,在72 h顯微鏡的圖片上細胞較小,邊緣清晰,胞內油脂含量較少,胞內色澤清亮透明;在80 h的時候酵母胞內綠色最深且色澤明亮,細胞也最大,胞內油脂聚集最多;從90、108 h的顯微鏡圖片中發現酵母細胞沒有增多,胞內油脂含量逐漸減少,細胞色澤變暗,由于酵母菌生長到一定階段的時候出現衰老及培養中產生的一些溶解胞壁的酶,致使細胞壁出現溶解現象,所以出現了培養時間越長就會出現自溶現象。因此,認為發酵至80 h時細胞完整及胞內油脂含量較高,終止發酵。

圖1 皮狀絲孢酵母油脂積累顯微圖片(40倍)Fig.1 Oil accumulation micrograph of T. cutaneum

2.2 皮狀絲孢酵母的生長曲線

從圖2可知,皮狀絲孢酵母在種子培養基中直接發酵和在利用種子培養液轉接于發酵培養基中的發酵的生長曲線相似。0～6 h,生長緩慢,是皮狀絲孢酵母的發酵適應期;6～25 h時,曲線呈上升趨勢,此期間為皮狀絲孢酵母的生長對數期;從25～65 h,菌體生長緩慢,生長曲線平穩增加,此期間為皮狀絲孢酵母的穩定期;從65 h后,種子培養基直接發酵的菌體不再增加,生長曲線不再變化;而用種子液轉接的發酵培養液中菌體還在繼續緩慢增長;到120 h以后,菌體數量逐漸減少,說明皮狀絲孢酵母到了衰退期。本實驗的結果說明了皮狀絲孢酵母有無種子轉接的生長情況基本一致,這就為進行工業化一步法發酵生產提供了依據。

圖2 皮狀絲孢酵母生長曲線圖Fig.2 The growth curve of T. cutaneum

2.3 糖氮代謝及pH的變化

從圖3可以看出,隨著發酵時間的延長,發酵液中pH在逐漸下降,到了第80 h之后,pH緩慢趨于穩定,在3.5之間徘徊,說明皮狀絲孢酵母在發酵過程中產酸,發酵時需要實時調節pH穩定至中性。從圖4、圖5中可以看到,在對數期時,培養基中糖的濃度下降速度較低,而氮的濃度下降速度較快,說明細胞增長速度較快,耗氮速度快。到了穩定期時,發酵液中氮的濃度基本趨于穩定,說明菌體生長緩慢,基本不再消耗氮源,發酵液中糖的濃度下降明顯,說明油脂在細胞內不斷合成。在發酵到90 h以后,發酵液中糖與氮的濃度基本沒有變化,發酵液中還有一部分的糖和氮剩余。由于油脂的產生需要糖來轉化,培養基中糖的初始含量過高,也會影響氮的消耗,反之也會互相影響,最后導致微生物的生長和產油受到制約,所以后期優化培養基成分時,可以適當調整培養基中糖氮的比例來促進皮狀絲孢酵母的產油量和糖氮利用。

圖3 不同時期發酵液pHFig.3 pH of fermentation broth during different periods

圖4 不同時期發酵液中糖濃度Fig.4 Sugar concentrations of fermentation broth during different periods

2.4 生物量及油脂產量

由圖6可知,當皮狀絲孢酵母發酵80 h時,含油量達到最高,含油量為3.66 g/L,得油率為39.20%。發酵90 h左右時得油率大幅度下降,所以皮狀絲孢酵母最佳的發酵時間約為80 h左右。

表1 皮狀絲孢酵母胞內油脂各組分質量分數Table 1 The content percentages of each fatty acid component in total lipid of T. cutaneum

2.5 皮狀絲孢酵母胞內油脂脂肪酸組分測定

圖5 不同時期發酵液中氮濃度Fig.5 Nitrogen concentrations of fermentation broth during different periods

圖6 不同時期生物量和油脂產量 Fig.6 Biomass and oil productions during different periods

由總離子流圖(圖7)和表1可知,飽和脂肪酸占97%,棕櫚酸含量最高占53.2%,其次為油酸占24.1%,不飽和脂肪酸的含量較低,這些脂肪酸成分與作為生物柴油原料的植物油料作物的脂肪酸成分相似。因此,皮狀絲孢酵母的胞內油脂可作為制備生物柴油的原料。

圖7 皮狀絲孢酵母胞內油脂脂肪酸的總離子流圖Fig.7 Typical total ion chromatogram of total lipid of T. cutaneum

3 結論與討論

皮狀絲孢酵母為產油脂酵母,其含油量為3.66 g/L,含油率為39.20%,最佳的發酵時間為80 h。皮狀絲孢酵母發酵至對數期時氮消耗較快,發酵至穩定期時糖消耗較快,并且在種子培養基中直接發酵和從種子培養液轉接至發酵培養基中發酵,兩者的生長曲線比較相似,表明皮狀絲孢酵母可以進行一步法發酵;皮狀絲孢酵母在發酵過程中pH從6下降至3.5左右,表明其在發酵過程中產酸。

實驗數據還表明,皮狀絲孢酵母的脂肪酸組成與植物油脂的脂肪酸組成相似,所產油脂的脂肪酸主要為飽和脂肪酸,如C16、C18,而這類脂肪酸又易于進行脂交換反應,可在甲酯化后獲得硬脂酸甲酯、亞油酸甲酯,所以皮狀絲孢酵母的胞內油脂可作為制備生物柴油的原料[19-24]。

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Study on production of oils fromTrichosporoncutaneum

LIU Meng1,ZHENG Cao1,TIAN Hua1,FU Jie1,CHEN Tao2,HE Dong-ping1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China; 2.Wuhan Institute of Virus,Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430071,China)

This study focused on the growth development and oil synthesis ofTrichosporoncutaneum. The morphology ofT.cutaneum,OD value,sugar and nitrogen concentrations,pH,oil content and the profile of the total fatty acid were individually measured and analyzed. The study demonstrated that the quantity of extracted oils fromT.cutaneumwas well agreed with its intracellular oils at 80 h,at this time the production and content of oil were 3.66 g/L and 39.20%,respectively. Meanwhile,results showed that the time from 0 h to 6 h was the lag phase,at which the consumptions of sugar and nitrogen were obvious,and the cell numbers was increased slowly. From 6 h to 25 h,the concentrations of sugar and nitrogen were rapidly decreased,and the cell numbers was largely increased,thus this period represented the logarithmic phase. From 25 h to 120 h,the consumption rate of sugar was higher than that of nitrogen,and the intracellular oils were gradually accumulated at this period,which named stationary phase. Thereafter,cells entered into decline phase,at which the concentrations of sugar and nitrogen were maintained constantly at low levels. More importantly,long chain saturated fatty acids were the most mainly fatty acid in total lipid ofT.cutaneum,giving a new source for the preparation of biodiesel.

Trichosporoncutaneum;analysis of the fatty acid composition;metabolism of sugar and nitrogen

2016-09-09

柳夢(1994-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物油脂，E-mail：13720325344@163.com。

*通訊作者:何東平(1957-)，男，博士，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白，E-mail：hedp123456@163.com。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0150-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.016