海南發酵食品魚茶中乳桿菌發酵特性的研究

徐傳標,霍冬雪,胡淇淞,李從發,張家超

(海南大學食品學院,海南海口 570228)

海南發酵食品魚茶中乳桿菌發酵特性的研究

徐傳標,霍冬雪,胡淇淞,李從發,張家超*

(海南大學食品學院,海南海口 570228)

在前期研究中,從海南省傳統發酵食品魚茶中分離獲得144株乳桿菌,主要隸屬于植物乳桿菌、戊糖片球菌、香腸乳桿菌、短乳桿菌、棒狀乳桿菌、鼠李糖乳桿菌及干酪乳桿菌等。本文從發酵應用的角度出發,對分離得到的乳桿菌進行了一系列的魚肉發酵特性實驗,包括pH變化率實驗,耐食鹽、耐亞硝鹽實驗、氨基酸脫羧酶實驗等。實驗結果表明:R19-5,M1-4,R21-3,R21-4和RD-1五株菌具有快速產酸能力,經過12～16 h發酵后,pH分別能達到3.75、3.89、3.86、3.73和3.74,同時都能耐受150 mg/kg NaNO2溶液和8%鹽濃度;菌株在發酵時都不產氨基酸脫羧酶。綜合實驗結果,篩選出具有優良發酵特性的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)3株,香腸乳桿菌(Lactobacillusfarciminis)1株和短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)1株。本研究將對尋找優良的肉制品發酵劑和合理利用新的生物資源具有一定的理論指導作用。

魚茶,乳桿菌,發酵性能

海南魚茶是我國海南黎族和苗族的一種傳統淡水全魚發酵制品,產品具有回甜咸鮮、香氣獨特、回味醇厚、保質期長等特點,其是一種高蛋白、低脂肪、富含多種游離氨基酸的風味食品。本課題組對魚茶制品進行了菌相分析，分離出制品中乳酸菌同時對可培養部分的菌進行分離純化后測序鑒定出其種屬關系。其中乳酸菌包括植物乳桿菌、戊糖片球菌、香腸乳桿菌、短乳桿菌、棒狀乳桿菌、鼠李糖乳桿菌及干酪乳桿菌等144株[1]。

在熱帶或亞熱帶地區,人們為了在高溫、高濕度條件下保存魚肉,采用發酵的方式加工傳統發酵魚制品。發酵魚制品具有濃郁的發酵風味,還具有獨特的保健作用,深受當地人民的喜愛。國內外學者對發酵魚制品進行研究,其中東南亞地區的Nampla、Bakasang[2-3]等傳統發酵魚制品進行了菌相分析和優勢菌種的篩選,發現乳酸菌為重要的優勢菌群,且與產品品質有著密切的關聯性。乳酸菌產生的細菌素能抑制或殺死食源性致病菌,應用生物發酵方法來保持和改善肉類制品的品質或抑制腐敗菌的生長是一種很好的食品加工保藏方法[4],同時乳酸菌還有重要的益生功效,如抗癌、降膽固醇、抗氧化、抑菌抗病等[5-8]。但海南魚茶發酵制品自然發酵方法進行手工作坊式生產,存在著發酵時間長、產品質量穩定性差、安全性低等問題。在自然發酵的情況下存在著其他雜菌生長代謝影響產品的安全性及穩定,并且不同型乳酸菌代謝也會極大的影響產品的風味。發酵劑的選擇對發酵制品后期成品的組織結構,安全,風味等特性起關鍵性作用。

表2 海南魚茶中分離出的乳酸菌的耐鹽實驗Table 2 Salt tolerance test of lactic acid bacteria isolated from Hainan Yucha

注:1:分離的菌株數2:實驗存活百分含量(%)，是指占該類菌株的百分含量。表3、表4同。本課題組對魚茶制品菌相分析,發現乳酸菌是重要的優勢菌,而迄今為止,對海南魚茶制品中乳酸菌的菌種特性尚無相關報道。本研究也是首次對海南傳統發酵魚茶制品中存在的乳酸菌菌株特性的考查,對改進我國魚發酵制品傳統發酵工藝、實現其工業化生產具有理論指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

于魚茶制品中分離出的144株乳桿菌(已完成分離鑒定見表1)。

表1 魚茶中微生物分離鑒定結果Table 1 Results of isolation and identification of microorganisms in Yucha

蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、瓊脂、酵母膏、溴甲酚紫、精氨酸、半胱氨酸等 BR 級;膽鹽、NaCl、檸檬酸二銨、KH2PO4、NaOH、HCl、NaNO2等試劑 AR 級;MRS 培養基 廣東環凱微生物科技有限公司。

PB303-N型電子精密天平 梅特勒-托利多儀;RE-5203AA型立式旋轉蒸發儀 上海亞榮儀器設備有限公司;YXQ SG41.280型高壓蒸汽滅菌鍋 上海醫用核子儀器廠;CSY-2型超凈工作臺 上海凈化設備廠;TD5M型臺式低速離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的生長性能及pH變化率 采取Ammor等人[9]的方法并做修改。將分離得到的不同乳酸菌株接種到MRS 液體培養基中培養,同時以未接種的MRS 液體培養基作空白對照,37 ℃培養0 h開始每隔2 h后分別測定其pH。

1.2.2 耐鹽性實驗、耐亞硝鹽測定 采用胡永金等人[10]和趙亞娟等人[11]方法并做修改。將活化后待測乳酸菌株以1%(v/v)接種至含有2%、4%、8%、10%的NaCl濃度,0、50、100、150 mg/kg的NaNO2濃度液體MRS 培養基中,分別在37 ℃厭氧培養36 h和24 h,同時做空白對照,于λ=600 nm 處測定其OD 值。

1.2.3 氨基酸脫羧酶實驗方法 采用Ammor等人[9]的并做修改。將活化后的待測菌株分別按1%(v/v)接入添加有1%(m/v)組氨酸、酪氨酸、賴氨酸及鳥氨酸的含0.06%溴甲酚紫作為指示劑的MRS 培養液中,37 ℃厭氧培養7 d后觀察培養液顏色變化,顏色由黃變紫表示菌株氨基酸脫羧酶活性陽性。

1.2.4 數據處理與統計分析 所得數據為三次測定值的平均值,通過Excel 2010 進行數據處理,用origin作圖。

2 結果與分析

2.1 耐鹽、耐亞硝酸鹽測定

根據比濁法原理,以菌株在MRS 液體培養基OD 值的變化,作為微生物生長指標,研究菌株的耐鹽和耐亞硝酸鹽特性。實驗結果如表2所示。

由表2可得出,篩出的菌株均能耐受4%鹽濃度,8%鹽濃度下對一些菌有抑制作用但是其中13.4%乳桿菌,5.6%戊糖乳桿菌,4.2%香腸乳桿菌能耐受8%鹽濃度,所測試菌株均不能耐受10%鹽濃度。經過耐鹽初篩出的42株乳酸菌進行耐鹽硝酸實驗,結果見表3,篩選出的菌株在150 mg/kg濃度下的硝酸鹽環境下生長正常,均未出現對其產生抑制作用。

表3 海南魚茶中分離出的乳酸菌的耐亞硝酸鹽實驗Table 3 Nitrite tolerance test of lactic acid bacteria isolated from Hainan Yucha

表4 氨基酸脫羧酶實驗結果Table 4 Test results of amino acid decarboxylase

注:“-”表示實驗結果為陰性。2.2 乳酸菌的生長性能及pH變化率

2.2.1 乳酸菌生長曲線 由圖1,乳酸菌R19-5,M1-4,R21-3,R21-4,RD-1等五株菌在2 h后進入生長對數期,12～14 h 后達到生長穩定期,而其他乳酸菌進入對數期的時間較上述五株菌稍有延后,但其進入穩定期時間相一致。

圖1 生長曲線Fig.1 Growth curve

2.2.2 pH變化率 乳酸菌生長過程的pH變化率見圖2,6株植物乳桿菌和其他6株菌顯示了較快的pH變化率,在37 ℃,14 h和16 h 內分別使pH迅速降至4.0以下。pH變化表明,乳酸菌R19-5,M1-4,R21-3,R21-4,RD-1均能快速形成乳酸,12 h后pH由起始的pH5.87降至pH3.8左右,而后趨于緩慢下降,在20 h后pH分別能達到3.75、3.89、3.86、3.73、3.74。

圖2 pH變化Fig.2 pH change of the samples

2.3 氨基酸脫羧酶實驗

經過耐鹽篩選后,對42株菌進行氨基酸脫羧酶實驗,通過表4可確定其中所有菌株均未有產氨基酸脫羧酶的陽性反應。

3 討論與結論

乳酸菌的生長性能和產酸能力在發酵過程中起著重要的作用,接入基質中后在經歷盡可能短的停滯期后,乳酸菌應能夠迅速增殖,快速積累乳酸,以減少致病菌和腐敗菌生長導致的危害[15]。快速的產酸能夠有效抑制致病菌的生長、加速產品風味的形成、促進產品色澤形成等作用。RingoE[16]等人研究了9株乳酸菌對魚源致病菌抗菌活性研究發現,其所產的乳酸等酸能抑制病原菌的生長。所測試的菌株具備快速產酸能力,其中由生長曲線圖發現12株菌進入穩定期后曲線很快下降的原因可能是在三角瓶中發酵受限于容積和營養物質的消耗。測試菌株在12～16 h能達到穩定期而文獻中大多是16～22 h才能達到,這可能是乳酸菌在培養時與其設置的溫度相關,文獻中采用多采用30 ℃,而本次實驗選取37 ℃培養從而使其代謝增快而導致的[17],其次可能是菌株的生長特性。

生物胺(biogenic amines,Bas)是一類含氮的脂肪族、芳香族或雜環類有機化合物的總稱。國外學者研究認為BAs在發酵肉制品中普遍存在,特別是在發酵香腸中發酵食品中的BAs主要是由于游離氨基酸被微生物產生的脫羧酶脫羧形成[18-19]。發酵肉制品中的部分乳酸菌具有氨基酸脫羧酶活性,尤其在低pH和高水分含量的條件下,它們往往脫羧某些特定的氨基酸,生成酪胺、組胺、尸胺、腐胺及苯基乙胺。這些化合物不僅會影響發酵食品的風味而且其會對人健康產生危害。因而,研究海南傳統魚茶制品中的乳酸菌是否具有氨基酸脫羧酶活性,對了解魚茶制品的安全品質及產品是否具備推廣價值具有十分重要的意義。

優良的肉制品發酵劑具有安全性,耐6%鹽,耐亞硝酸,在15～40 ℃下生長,快速產酸抑菌等特性[18]。本文研究擬在海南的傳統魚茶制品中分離出乳酸菌并對分離出的乳酸菌進行篩選,以期篩選出具有潛在優良商業價值的肉制品發酵劑。本文在海南魚茶制品中共分離出144株乳酸菌基礎上,分別對各菌株進行生理生化、pH變化率、耐鹽及亞硝酸鹽、氨基酸脫羧酶及生長曲線的菌株特性研究。實驗發現3株植物乳桿菌(R19-5,M1-4,R21-3),1株香腸乳桿菌(R21-4)和1株短乳桿菌(RD-1)具有產酸速率快、高耐鹽、無氨基酸脫羧酶活性等特性,并發現其具有開發成淡水魚發酵制品發酵劑的潛力。

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Fermentation characteristics ofLactobacillusisolated in Hainan fermented food Yucha

XU Chuan-biao,HUO Dong-xue,HU Qi-song,LI Cong-fa,ZHANG Jia-chao*

(College of Food Science,Hainan University,Haikou 570228,China)

In previous study,a total of 144 strains ofLactobacilluswere isolated from Yucha,a traditional fermented food of Hainan province. After identification,these strains mainly belonged to theLactobacillusplantarum,Lactobacilluspentosus,Lactobacillusfarciminis,Lactobacillusbrevis,Lactobacilluscasei,LactobacilluscoryniformisandLactobacillusrhamnosus. From the perspective of fermentation application,we had made a series ofLactobacillusfermentation characteristic test,including acidification rate test,resistance to salt and the nitrate test,amino acid decarboxylase test. Experimental results showed that:R19-5,M1-4,R21-3,RD-1and R21-4 had fast capacity of acid,after 12～14 h after fermentation,pH can reach 3.75,3.89,3.86,3.89 and 3.86,both tolerated concentration of 150 mg/kg NaNO2and 8% NaCl. Strains in the fermentation did not produce amino acid decarboxylase. The results showed that 3Lactobacillusplantarumstrains,1Lactobacillusfarciminisstrain and 1Lactobacillusbreviswith excellent fermentation characteristics were selected based on the comprehensive test. This research had certain theoretical guidance for looking for excellent meat starter cultures and rational utilization of biological resources.

Yucha;Lactobacillus;fermentation;performance

2016-10-24

徐傳標(1990-),男,碩士研究生,研究方向:食品微生物,E-mail:myyou163@163.com。

*通訊作者:張家超(1986-),男,博士,教授,研究方向:食品微生物,E-mail:zhjch321123@163.com。

海南省高等學校科學研究項目(Hnky2016-12);海南大學科研啟動基金(KYQD1548)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0117-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.004