鐵皮石斛多糖分子量測定及其影響因素分析

黃俊彬,黃丹丹,陳歡歡,李運容,魏 剛

(廣州中醫藥大學中藥學院,廣東廣州 510006)

鐵皮石斛多糖分子量測定及其影響因素分析

黃俊彬,黃丹丹,陳歡歡,李運容,魏 剛*

(廣州中醫藥大學中藥學院,廣東廣州 510006)

目的:研究了鐵皮石斛多糖的分子量及其主要的影響因素。方法:對鐵皮石斛多糖進行了三次重復的提取分離,經過纖維素凝膠樹脂DEAE-52和葡聚糖凝膠Sephacryl S-300柱進行純化,得到一個多糖片段WDOPA并采用高效凝膠滲透色譜法進行多次的分子量測定。采用單因素比較的方法,分別用加熱和超聲的手段處理鐵皮石斛多糖,考察不同的加熱溫度、時間及不同的超聲功率、時間對鐵皮石斛多糖分子量的影響。結果:該WDOPA的分子量為776054 u,RSD在10%以內,加熱的溫度及時間對多糖分子量的影響不明顯,而超聲功率、超聲時間的不同對鐵皮石斛多糖分子量影響較大,隨著超聲功率的加大及時間的延長,分子量逐漸變小。結論:該實驗方法可用于測定多糖,且超聲可用于改變鐵皮石斛多糖的分子量,應用于篩選不同分子量的多糖片段。

超聲降解,高效凝膠滲透色譜法,鐵皮石斛,多糖,分子量

鐵皮石斛作為石斛中的佳品,在現代研究中發現,其具有良好的抗氧化[1]、抗腫瘤[2]、降低血糖[3]以及提高機體免疫力[4]等作用。根據現在的植物化學成分及藥理學分析,石斛的主要的活性成分為石斛多糖,且含量十分豐富[5],但由于提取、分離的方法不同,現有的文獻中石斛多糖的分子量差異較大,從一百多萬到幾千的分子量都有[6],而不同的分子量片段的石斛多糖,活性的差異也較大[7]。可能影響到分子量大小的因素有提取、分離及純化的方法,溫度和時間等[8]。纖維素凝膠樹脂和葡聚糖凝膠柱為常用的分離純化方法[9]。

超聲提取法作為一種簡單高效的提取方式,在多糖的溶解過程中經常被采用,很多研究報道了超聲提取法可以明顯提高多糖的提取效率[10],但超聲的方法是否會改變石斛多糖的結構及生物活性具有一定的不確定性,因此,探討超聲對石斛多糖的分子量是否有影響將對石斛多糖的研究具有重要的參考意義。

基于此,本研究對鐵皮石斛多糖進行了三個批次的分離純化及多次的分子量測定,并探討超聲的時間、功率以及加熱的溫度及時間對鐵皮石斛多糖分子量的影響,以期可以得到一種可行的方法來獲取不同分子量的石斛多糖片段,本實驗首次進行了多次的重復性提取及測定來確定其分子量范圍,且得到了一個分子量范圍較為穩定的多糖片段WDOPA,對石斛產業的開發利用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛鮮條 批號20140412,購于淘寶店,經廣州中醫藥大學魏剛研究員鑒定為鐵皮石斛。

葡聚糖T系列(5000 u,批號00269;11000 u,批號00270;80000 u,批號00892;15000 u,批號00893;273000 u,批號00894;667000 u,批號00896) 美國sigma公司;DEAE纖維素DE-52 上海源葉生物科技有限公司;Sephacryl S-300 High Resolution GE公司。

純凈水 華潤怡寶食品飲料(深圳)有限公司;石油醚 天津市百世化工有限公司;濃硫酸 廣州市東紅化工廠;苯酚 天津市永大化學試劑有限公司;無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、乙酸銨等 天津市大茂化工試劑廠 均為分析純。

LC-20AT型高效液相色譜儀 日本島津公司;蒸發光散射檢測器ELSD 6000 廣州萬譜儀器有限公司;AB204-N型精密電子天平 梅特勒-托利多(Mettler Toledo)公司;KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;電熱套TC-15套式恒溫器 新華市醫療器械廠;TD-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠;SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;中壓層析柱(3.5 cm×55 cm)、中壓層析柱(1.6 cm×80 cm)、HL-2D恒流泵、BS-100A自動部分收集器 上海滬西儀器分析有限公司;PL1149-1840凝膠色譜柱(Agilent,PL aquagel-OH MIXED-H 8 μm,300 mm×7.5 mm)、PL1149-6800保護柱(Agilent,PL aquagel-OH Guard 8 μm,50 mm×7.5 mm) 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鐵皮石斛粗多糖的提取制備 取鮮品鐵皮石斛洗凈泥沙,切碎,60 ℃烘干后打粉,過一號篩。精密稱取10 g鐵皮石斛粉末,置于1000 mL的圓底燒瓶中,加入石油醚100 mL,加熱回流2 h,取出,放冷,濾過,棄去濾液,濾渣烘干后重新置于1000 mL的圓底燒瓶中,加入80%的乙醇加熱回流2 h,取出放冷,濾過,棄去濾液。濾渣重新加入圓底燒瓶,加入純凈水300 mL,加熱回流提取2 h,重復提取三遍,提取液4000 r/min離心10 min除去藥渣,抽濾,合并濾液,減壓濃縮至合適的體積,放冷,并邊攪拌邊緩慢的加入四倍體積的無水乙醇醇沉,得到白色絮狀的多糖沉淀,并置于4 ℃冰箱過夜。4000 r/min離心10 min得到多糖,置于60 ℃烘箱烘干。將多糖重新溶解至合適的體積,置于分液漏斗中,根據樣品和sevag試劑(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1)的體積比為4∶1的比例,緩慢加入sevag試劑,振蕩5 min,靜置后棄去下層溶液,并離心,5000 r/min,離心15 min,重復三次除去多糖溶液中的蛋白。最后,將上層溶液移出,重新加入四倍體積的無水乙醇醇沉,4000 r/min離心10 min得到多糖,置于60 ℃烘箱烘干,得到粗多糖,稱重為2.2 g。按以上全部流程重復提取三份鐵皮石斛樣品,分別得到三個批次的鐵皮石斛粗多糖YN1、YN2、YN3。密封干燥保存,備用。

1.2.2 鐵皮石斛多糖進行纖維素凝膠樹脂DEAE-52洗脫純化 取300 mg的粗多糖加入10 mL的蒸餾水溶解,待溶解完全后經0.45 μm的微孔濾膜過濾以備上樣。上樣量為300 mg/10 mL,流速為1 mL/min,采用純水洗脫,用自動收集器每10 min收集一管,并根據《中國藥典》的苯酚硫酸法[11]在λmax=488 nm處測定其吸光度,并繪制洗脫曲線,根據洗脫曲線收集洗脫液,濃縮,冷凍干燥,得到多糖。三個批次的粗多糖分別上樣。

1.2.3 鐵皮石斛多糖進行葡聚糖凝膠Sephacryl S-300洗脫純化 將上述1.2.2得到的多糖取100 mg重新溶解于5 mL水中,待溶解完全后經0.45 μm的微孔濾膜過濾以備上樣。上樣量為100 mg/5 mL,流速為0.5 mL/min,采用0.2 mol/L的NaCl溶液洗脫,用自動收集器每10 min收集一管,并根據《中國藥典》的苯酚硫酸法測定在λmax=488 nm處其吸光度,并繪制洗脫曲線,根據洗脫曲線收集洗脫液,濃縮,透析,冷凍干燥,得到多糖片段WDOPA。三個批次的多糖分別上樣。

1.2.4 加熱溫度及時間對鐵皮石斛多糖分子量的影響 分別精密稱取粗多糖樣品5 mg共9份,再分別加入2 mL的蒸餾水,振蕩使其充分溶解。9份樣品依次編號為62,64,66;82,84,86;102,104,106三組,分別表示在60 ℃的水浴中加熱2、4、6 h;80 ℃的水浴中加熱2、4、6 h;100 ℃的水浴中加熱2、4、6 h。樣品加熱完之后,冷卻,用0.22 μm的水系微孔濾膜過濾,轉移至液相瓶中,即得供試品溶液。

1.2.5 超聲功率及時間對鐵皮石斛多糖分子量的影響 分別精密稱取粗多糖樣品5 mg共12份,再分別加入2 mL的蒸餾水,振蕩使其充分溶解。12份樣品依次編號為11,12,13,14;21,22,23,24;31,32,33,34;三組,使用KQ-400KDE型高功率數控超聲(功率4000 W),分別表示在40%的功率下超聲降解0.5,1,2,4 h;70%的功率下超聲降解0.5、1、2、4 h;100%的功率下超聲降解0.5、1、2、4 h;降解完成之后,用0.22 μm的水系微孔濾膜過濾,轉移至液相瓶中,即得供試品溶液。

1.3 數據統計分析

該實驗采用了重復三遍的方法分別進行測定,采用單因素方法比較超聲及加熱對鐵皮石斛多糖分子量的影響,結果以平均值及相對標準偏差的方式表示,計算結果根據標準曲線lgMw-RT推算其分子量。

2 結果與討論

2.1 三個批次的鐵皮石斛多糖DEAE-52洗脫曲線

三個批次YN1、YN2、YN3多糖的DEAE-52吸光度測定圖1所示:可以看出,各個批次的DEAE-52洗脫曲線基本相似,只是吸光度的大小有所差異,代表洗脫下來的多糖含量的高低不同,而有吸收的范圍是基本一致的,可以用于確定大致需要的洗脫時間。分別按其主要吸光度范圍合并相應管數的多糖溶液,濃縮,干燥。

圖1 三個批次的DEAE-52洗脫曲線Fig.1 The elution curves for three batches of DEAE-52

2.2 三個批次的鐵皮石斛多糖Sephacryl S-300洗脫曲線

三個批次YN1、YN2、YN3多糖的Sephacryl S-300吸光度測定圖2所示:三個批次的Sephacryl S-300洗脫曲線基本相似,而吸光度的大小存在差異,有吸收的管數存在細微的差別,故分別收集吸光度較大且共有的第一個峰的管數,即第21～45管的多糖溶液,合并,濃縮,透析,干燥。

圖2 三個批次的Sephacryl S-300洗脫曲線Fig.2 The elution curves for three batches of Sephacryl S-300

2.3 高效凝膠滲透色譜法測定標準曲線

在多糖分子量的測定中,本實驗采用了高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測定多糖的分子量,它具有快速、分辨率高,重現性好的特點[12-13]。分別稱取已知分子量的葡聚糖標準品(5000,11000,80000,150000,273000,667000 u)各10 mg溶解于2 mL的純凈水中,待完全溶解后經微孔濾膜過濾,采用高效液相色譜儀和蒸發光散射檢測器,進樣量為5 μL,安捷倫凝膠色譜柱(Agilent,PL aquagel-OH MIXED-H 8 μm,300 mm×7.5 mm)與保護柱(Agilent,PL aquagel-OH Guard 8 μm,50 mm×7.5 mm)串聯,流動相為20 mmol/L乙酸銨溶液,流速為0.5 mL/min,柱溫箱40 ℃,漂移管110 ℃,氣體流速2.0,增益1。根據標準品的保留時間及分子量,做出lgMw-RT標準曲線。實驗結果如下,六個標準品的保留時間依次如下為19.97、19.40、17.50、17.00、16.66、16.12 min。根據標準品的保留時間及分子量,做出lgMw-RT標準曲線。如圖3所示,y=-0.5258x+14.191,r=0.9959,表明線性關系良好。

圖3 lgMw-RT標準曲線Fig.3 The standard curve lgMw-RT

2.4 精密度實驗

取葡聚糖標準品(11000 u)供試品按2.3的液相條件,連續進樣5次,根據其保留時間,計算其RSD。五次保留時間如下:19.40、19.390、19.37、19.42、19.39 min。根據lgMw-RT標準曲線,經計算,五次的平均分子量為9744 u,其RSD為2.3%,說明其精密度良好。

2.5 重復性實驗

精密稱取5份粗多糖樣品各5 mg,再分別加入2 mL的純凈水,振蕩使其充分溶解,用0.22 μm的水系微孔濾膜過濾,轉移至液相瓶中,即得供試品溶液。將五份供試品按2.3的液相色譜條件分別進樣,根據其保留時間,計算其RSD。五次樣品的保留時間依次如下:15.08,15.03,15.03,15.03,15.07 min。根據lgMw-RT標準曲線,經計算,五次的平均分子量為1958855 u,其RSD為2.7%,說明其重復性良好。

2.6 穩定性實驗

取編號31供試品放于4 ℃的冰箱中保存,分別于0,2,6,12,24 h后按2.3的液相條件進樣,根據其保留時間,計算其RSD。五次進樣的保留時間依次如下:16.28,16.34,16.33,16.32,16.31 min。根據lgMw-RT標準曲線,經計算,五次的平均分子量為416913 u,其RSD為2.8%,說明其樣品的穩定性良好。

2.7 三個批次的鐵皮石斛多糖片段的分子量測定

按照步驟2.3的液相色譜方法,依次將三個批次的鐵皮石斛多糖WDOPA片段進行分子量測定,根據其樣品保留時間及lgMw-RT標準曲線計算各自的分子量。并將這三個批次的樣品送外檢,結合兩組數據,其計算結果如表1所示,從實驗結果可見,由本課題組自己測定的三個批次的多糖的分子量分別為757623,851008,706703 u;平均分子量為771778 u,RSD為9.5%,外檢的分子量數據為751703,838119,751169 u,平均分子量為780330 u,RSD為6.4%,兩組數據的平均分子量為776054 u,RSD為7.3%。本實驗不僅獲得了一個相對穩定的鐵皮石斛多糖片段WDOPA,可以為多糖藥理方面的研究提供一定的實驗基礎。

表1 三個批次的WDOPA多糖分子量(u)Table 1 The molecular weight of three batches of WDOPA polysaccharide(u)

2.8 加熱溫度及時間對鐵皮石斛多糖分子量的影響

按照步驟2.3的液相色譜方法,依次將樣品進樣測定保留時間,再根據lgMw-RT標準曲線計算各自的分子量。實驗結果及圖譜如表2和圖4所示;從實驗結果中可以發現,加熱的溫度及時間對鐵皮石斛多糖的分子量影響不是很大,隨著長時間的加熱及溫度的提高,鐵皮石斛多糖的分子量有微小的變小,但趨勢不明顯。

表2 加熱溫度及加熱時間對分子量的影響Table 2 The effects of heating temperature and heating time dealing on the molecular weight

圖3 lgMw-RT標準曲線Fig.3 The standard curve lgMw-RT

2.9 超聲功率及時間對鐵皮石斛多糖分子量的影響

圖4 加熱組HPGPC液相圖譜Fig.4 The HPGPC chromatography of the heating group

圖5 40%超聲功率的HPGPC液相圖譜Fig.5 The HPGPC chromatography under 40% ultrasonic power

按照步驟1.2.2的液相方法,依次將樣品進樣測定保留時間,再根據lgMw-RT標準曲線計算各自的分子量。實驗結果及圖譜如表3和圖5～圖7所示;從結果中我們可以發現:超聲的功率及時間對鐵皮石斛多糖的分子量影響明顯,隨著超聲功率的加大及超聲時間的加長,鐵皮石斛多糖的分子量逐漸減小,即超聲功率越大,分子量越少,超聲時間越長,分子量越小。且當多糖分子量降低到一定程度后,下降得趨勢逐漸變緩。

表3 超聲功率及超聲時間對分子量的影響Table 3 The effect of ultrasonic power and ultrasonic time dealing on molecular weight

圖6 70%超聲功率的HPGPC液相圖譜Fig.6 The HPGPC chromatography under 70% ultrasonic power

圖7 100%超聲功率的HPGPC液相圖譜Fig.7 The HPGPC chromatography under 100% ultrasonic power

3 結論

本實驗主要采用高效凝膠滲透色譜法測定鐵皮石斛的多糖分子量,液相條件為20 mmol/L的乙酸銨單溶劑測定,只需通過計算保留時間推算其分子量。實驗操作主要為加熱及超聲等單因素考察,簡單易行,重現性較好。由結果表明,本實驗得到的WDOPA多糖片段具有較高的穩定性,其分子量為78萬左右,在10%的誤差范圍之內。且加熱和超聲均能影響鐵皮石斛多糖分子量,但超聲的作用效果更為明顯。因此,加熱和超聲降解的方法可運用于得到分子量較小的鐵皮石斛多糖片段。

在現在的鐵皮石斛產業應用中,鐵皮石斛類產品的開發是一個熱點。大分子的多糖不僅溶解度較低,且活性并不是很明顯。通過降低鐵皮石斛多糖的分子量,可以明顯改善石斛多糖的溶解度,有利于解決石斛飲料及酒劑的這一工藝難題,并明顯改善鐵皮石斛多糖的藥用價值,這對鐵皮石斛保健品的開發具有很大的應用價值。本實驗過程中獲得了多個不同分子量的多糖片段,但其結構及藥理活性是否存在差異,還有待進一步的研究。

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Determination of molecular weight ofDendrobiumofficinalepolysaccharides and its influencing factors

HUANG Jun-bin,HUANG Dan-dan,CHEN Huan-huan,LI Yun-rong,WEI Gang*

(School of Chinese Materia Medica,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangdong 510006,China)

Objective:In this study,the molecular weight of the polysaccharide fromDendrobiumofficinalewas detected and its main influence factors were discussed. Method:The polysaccharide of theDendrobiumofficinalewas obtained through extraction and isolation process. And the purified polysaccharide fraction named WDOPA was obtained using DEAE cellulose and sephadex gel Sephacryl S-300 column. The HPGPC method was performed to determine its molecular weight. The processing method for the polysaccharide fromDendrobiumofficinalewas heating and ultrasonic dealing. The influence factors such as heating temperature,heating time,ultrasonic power and duration time were investigated by single factor. Results:The molecular weight of WDOPA was 776054 u,RSD was within 10%. The heating temperature and time did not have significant effects on the molecular weight of the polysaccharide while the ultrasonic dealing had. As the ultrasonic power and duration time increased,the molecular weight of the polysaccharide decreased. Conclusion:This experimental method could be used for the detection of the molecular weight of the polysaccharide. Ultrasonic dealing would change the molecular weight of the polysaccharide fromDendrobiumofficinlae,this could be applied in produce polysaccharide with different molecular weight.

ultrasonic;High Performance Gel Permeation Chromatography(HPGPC);Dendrobiumofficinale;polysaccharide;molecular weight

2016-10-08

黃俊彬(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：創新中藥研究與指紋圖譜分析，E-mail：492818673@qq.com。

*通訊作者:魏剛(1969-)，男，本科，研究員，研究方向：創新中藥研究與指紋圖譜分析，E-mail：weigang021@163.com。

廣東省省級科技計劃項目(2013B060400022)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)07-0081-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.007