自擬葛花解酒滌脂湯對酒精性脂肪肝小鼠肝臟脂肪沉積及PXR表達的影響

易 旭，游紹偉，龍 毅，王碩石，陸道敏

(1. 貴陽中醫學院第二附屬醫院，中心實驗室，貴陽 550003；2. 貴陽中醫學院第二附屬醫院，消化內科，貴陽 550003)

研究報告

自擬葛花解酒滌脂湯對酒精性脂肪肝小鼠肝臟脂肪沉積及PXR表達的影響

易 旭1，游紹偉2*，龍 毅1，王碩石1，陸道敏1

(1. 貴陽中醫學院第二附屬醫院，中心實驗室，貴陽 550003；2. 貴陽中醫學院第二附屬醫院，消化內科，貴陽 550003)

目的 了解自擬葛花解酒滌脂湯對酒精性脂肪肝(AFLD)小鼠肝臟脂肪沉積的影響，并觀察其對肝組織孕烷受體(PXR)及其調控靶基因CYP3A11、CYP3A25蛋白及mRNA表達的影響。方法 將29只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為正常組(5只)，模型組(8只)，高劑量干預組(8只)、低劑量干預組(8只)。采用美國國立衛生研究院酒精濫用和酒精中毒研究所(NIAAA)方法制備AFLD小鼠模型，分別灌胃給予高、低劑量葛花解酒滌脂湯水煎劑干預，連續9 d。采用酶聯免疫吸附法檢測血清中谷丙轉氨酶(ALT)及谷草轉氨酶(AST)水平，組織病理學油紅O染色檢測肝臟脂肪沉積情況；實時熒光定量PCR及免疫組織化學方法分別檢測PXR、CYP3A11、CYP3A25 mRNA及PXR蛋白的表達。結果 與模型組比較，干預組小鼠肝臟脂肪沉積顯著減輕，呈劑量依賴性，具有比模型組和正常組顯著增加的PXR、CYP3A25表達水平(P< 0.01)；模型組小鼠血清ALT水平顯著增加(P< 0.01)，其余各組相似；各組CYP3A11mRNA轉錄水平差異無顯著性(P≥ 0.05)。結論 自擬葛花解酒滌脂湯對實驗小鼠AFLD具有明顯的治療作用，可能與促進PXR及其靶基因CYP3A25表達有關。

酒精性脂肪肝；葛花解酒滌脂湯；孕烷受體；CYP3A11；CYP3A25

酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)是由于過多的酒精攝入引起的肝細胞損傷性疾病，表現為脂肪變性與過量脂肪沉積，為目前臨床常見的疾病之一，也是酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)病情發展的重要因素，可逆轉也可進行性發展為酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化，甚至肝細胞癌[1]。隨著現代化生活方式的轉變，酒精和/或代謝因素誘導的肝病以及相關性疾病在迅速增加，酒精濫用和依賴已成為日益嚴重、國際社會越來越關注的公共衛生問題。針對AFLD的治療，目前尚無療效確切的化學藥物，并且多有肝腎功能損傷等副作用。研究發現，中醫藥干預酒精性肝損傷具有良好的臨床療效，對AFLD的治療效果優于現代醫藥，然而基礎研究也還未能闡釋其內在的作用機制[2, 3]。同時，由于AFLD證型繁雜，尚未尋找到實用的、可遵循的、較統一的方藥。課題組經過長期臨床積累，對AFLD辯證立法、遣方用藥的經驗加以歸納總結，自擬出由葛花、白茯苓、綿茵陳、小青皮、粉葛、決明子、山楂、明礬、甘草等9味藥組成的葛花解酒滌脂湯，葛花為君藥，治療上以解酒毒為先，擬通過制備AFLD小鼠模型及實施干預研究，探討該方藥對小鼠AFLD的影響，為臨床應用奠定初步的實驗室依據。孕烷X受體(PXR)被特征性地認為是異生物質或有害異物感受器，主要通過調控細胞色素酶P4503A(CYP3A)基因的表達抵御外源性物質引起的肝臟損傷[4-6]。因此，本文從PXR及其調控的CYP3A的角度探討葛花解酒滌脂湯對實驗小鼠AFLD干預作用的可能機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠29只，體重(21±2)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供【SCXK(京)2014-0004】。飼養于貴州醫科大學實驗動物中心帶有IVC系統的飼養房內【SYXK(黔)2015-0001】，SPF級小鼠用飼料喂養，自由飲用滅菌自來水，恒溫20～23℃。

1.2 試劑

葛花解酒滌脂湯(葛花，白茯苓，綿茵陳，小青皮，粉葛，決明子，山楂，明礬，甘草，由本院藥劑室提供，共計114 g，一煎加藥材量的10倍水，沸騰后煎30 min，過濾，二煎加藥材量的8倍水，沸騰后煎20 min，過濾，兩煎所得溶液混合，相當于生藥0.228 g/mL；Lieber-DeCarli酒精液體飼料及其對照液體飼料(南通特洛菲)；95%藥用酒精(C1526008，上海阿拉丁)；ALT、AST酶聯免疫吸附檢測試劑盒(CSB-E16539m，CSB-E12649m，武漢華美)，組織總RNA提取試劑盒(N3117，北京天根)，RNA逆轉錄試劑盒(00238763，美國Thermo)，SYBR Green Master Mix(A25742，美國Applied Biosystems)，抗-PXR抗體(ab192579，英國Abcam)，Envision免疫組化檢測試劑盒(GK500710，上海基因)，GAPDH、PXR、CYP3A11及CYP3A25上、下游引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 實驗動物分組及處理

29只C57BL/6J小鼠適應性喂養7 d后，按數字隨機表法分為正常組(5只)，模型組(8只)，高劑量干預組(8只)，低劑量干預組(8只)。參考文獻[7]，采用美國國立衛生研究院酒精濫用和酒精中毒研究所(NIAAA)方法制備AFLD小鼠模型，共計16 d。第17天起，參照實驗小鼠與人臨床用藥劑量體重換算標準，高劑量干預組與低劑量干預組小鼠分別按4.9、2.45 g/kg灌胃給予葛花解酒滌脂湯湯藥，正常組、模型組給予等量滅菌自來水灌胃，每天1次，共9次，正常SPF飼料喂養及自由飲用滅菌自來水。9 d后收集小鼠血液及肝組織樣本備用。

1.4 檢測指標和檢測方法

1.4.1 肝組織脂肪沉積鏡檢

肝組織樣本置于4%中性甲醛內固定24～48 h后，常規石蠟包埋，制成4 μm切片，行油紅O染色，光學顯微鏡下觀察肝組織脂肪沉積情況(由貴州醫科大學病理科協助完成)。

1.4.2 血清ALT、AST含量測定

小鼠血液經3000 r/min離心10～15 min后分離血清，參考試劑盒說明書采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法，經酶標儀檢測并計算樣品ALT、AST實際濃度(U/L)。

1.4.3 肝組織PXR、CYP3A11、CYP3A25基因轉錄水平

提取、純化小鼠肝組織總RNA，以1 μg總RNA于10 μL逆轉錄體系中進行逆轉錄；cDNA產物10倍稀釋后進行實時熒光定量PCR檢測，程序為：50℃ 2 min(1個循環)，95℃ 10 min(1個循環)，95℃ 15 s，60℃ 1 min(40個循環)。目的基因Ct值經同一樣本的內參基因校正后計算各組間每個基因的ΔCt，通過2-ΔCt計算組間對應基因的表達差異。GAPDH、PXR、CYP3A11及CYP3A25基因引物序列如下：

GAPDH F5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG，R5’-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3’；PXR F5’-CCCATC AACGTAGAGGAGGA-3’，R5’-TCTGAAAAACCCCT TGCATC-3’；CYP3A11 F5’- AGGGAAGCATTGAGG AGGAT-3’，R5’- GGTAGAGGAGCACCAAGCTG-3’；CYP3A25 F5’- GCCTTGCTTCAAACCAGAAG-3’，R5’- CATCATAGCCCCCGAAGATA-3’。

1.4.4 肝組織PXR蛋白表達的免疫組織化學檢測

參考DAKO公司EnVision免疫組化檢測試劑盒說明，肝組織切片經脫蠟、水化、抗原熱修復、3%H2O2滅活內源性過氧化物酶后，5%羊血清封閉20 min，滴加抗-PXR(Abcam公司，英國)4℃孵育過夜(陰性對照PBS液代替一抗)，次日滴加EnVision偶聯二抗，DAB顯色，蘇木素復染，氨水返藍，透明，封片。顯微鏡下觀察、計數陽性細胞百分比及著色程度，采用十三點評分法分析免疫組化結果[8](即以0-4分來判定陽性細胞的百分比：0分，沒有陽性細胞；1分，陽性細胞百分比小于10%； 2分，陽性細胞百分比大于10%但小于50%；3分，陽性細胞百分比大于50%但小于80%；4分，陽性細胞百分比大于80%；染色強度按陰性、弱、中、強染色分別評為0-3分。最終的評分是兩個指標的乘積)。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠一般情況觀察

AFLD小鼠模型制備過程中，精神狀態良好，毛色光滑，體重稍有減輕(變化范圍在1.7±0.3 g)。葛花解酒滌脂湯湯藥處理后，小鼠體重逐漸恢復并增至25.7±1.2 g，與正常組相似。整個實驗過程中無一只小鼠死亡。

2.2 小鼠肝臟脂肪沉積情況

正常組小鼠肝細胞油紅O染色后可見極少量脂滴沉積。模型組小鼠肝組織可見橘紅色的脂滴布滿鏡下視野。干預組肝臟脂肪沉積較模型組顯著減少，高劑量組尤其顯著，橘紅色的脂滴零星分布于肝組織。見圖1

2.3 血清ALT、AST水平

與正常組比較，模型組小鼠ALT水平顯著增加(P< 0.01)，高劑量干預組及低劑量干預組ALT含量與正常組相似(P≥ 0.05)。模型組AST含量較其余各組有輕度增加，但差異無顯著性(P≥ 0.05)。見表1

2.4 肝組織PXR、CYP3A11與CYP3A25 mRNA水平

與正常組和模型組比較，高、低劑量干預組均具有顯著上調的肝組織PXR及CYP3A25 mRNA轉錄水平(P< 0.01)；各組間CYP3A11mRNA轉錄水平相似，差異無顯著性(P≥ 0.05)。見圖2

2.5 肝組織PXR表達免疫組化檢測

與模型組比較，正常組小鼠肝細胞內可見弱陽性PXR表達，藥物干預組可見顯著的PXR陽性表達，尤其高劑量干預組。見圖3，表2

注：A：正常組；B：模型組；C：高劑量干預組；D：低劑量干預組。(下圖同)箭頭示肝組織內呈紅色的脂滴。(Bar=50 μm)圖1 各組小鼠肝組織油紅O染色鏡下結果Note. A: control group; B: Model group; C: High dose group; D: Low dose group. (The sama as in Fig.2)Arrows indicate the red lipid droplets in the liver tissue.Fig.1 The results of oil red staining in liver tissue of each group

注：與正常組比較，aP < 0.01；與模型組比較，bP < 0.01。圖2 各組小鼠肝臟PXR、CYP3A11及CYP3A25 基因表達的實時熒光定量PCR分析Note. compared with the control group, a P < 0.01; compared with the model group, bP < 0.01.Fig.2 Analysis the mRNA expression of PXR, CYP3A11and CYP3A25 by real-time fluorescent quantitative PCR in the liver tissues of mice in each group

注：A：正常組；B：模型組；C：高劑量干預組；D：低劑量干預組。箭頭示PXR表達陽性。(Bar=50 μm)圖3 各組小鼠肝臟PXR免疫組化表達情況Note. A: control group; B: Model group；C: High dose group；D: Low dose group. Allows indicate PXR expression positive. Fig.3 PXR expression through Immunohistochemistry in the liver tissues of mice in each group

表1 血清ALT、AST水平

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

Note. Compared with the control group,aP<0.01; Compared with the model group,bP<0.01.

3 討論

酒精性脂肪肝(AFLD)屬現代醫學概念，中醫學并無此病名。根據AFLD的臨床表現，當屬中醫學傷酒、酒積、癥瘕、脅病、積聚等之范疇。酒性大熱，其氣彪悍，有毒，又為濕熱之物。長期過度飲酒、嗜食肥甘，致濕熱內蘊，脾失健運，肝絡受損，氣血不和，日久氣血、濕熱、脂濁相互膠結，瘀于脅下所致。本證初起多為實證，若調治不善或漸損氣血，耗竭肝腎之陰，則易致肝腎陰虛，晚期多為虛實夾雜之證。針對AFLD的治療，現代醫學尚無特征性的、突出的治療方法，主要采取戒酒、合理膳食，配以常規護肝、降酶和控制血脂，但總體療效不理想。基于AFLD的治療現狀，我們緊密結合AFLD病因、病機，力求辯證施治，發揮中醫藥在AFLD治療中的獨特優勢。本文以動物實驗為基礎，采用病理、分子生物學等方法，探討自擬葛花解酒滌脂湯對ALFD的干預作用，期待為AFLD治療提供有效的治療方劑。葛花與葛根用于解酒在我國已有悠久的歷史，其解酒的研究涉及到了影響酒精吸收代謝、抗氧化、保肝及保護中樞神經系統方面等多個方面[9, 10]。綜合現代醫學研究的結果，認為葛花適用于酒精中毒和醉酒，葛根含ALDH2 成分，可用于治療酒精依賴和戒酒戒斷癥狀[11]，故本方以葛花為君藥，以解酒中之苛毒。方中粉葛為葛花之根，作為佐藥，與葛花一首一尾而施效；白茯苓作為輔君治療由脾虛濕痰壅盛而致的各種癥候群；綿茵陳輔佐葛花位居臣藥，對于濕熱內結所致諸證用而不疑；此方特選小青皮作為輔治肝郁氣滯的臣藥；決明子具有清肝明目，潤腸通便、降低血清膽固醇作用，佐助君藥以解目疾等癥；山楂具有消食化積，活血化瘀，降壓通痹之效，力佐君藥建功；明礬為佐藥，少量內服能祛痰燥濕，清污澄濁；甘草既是使藥又是佐藥，具有健脾和中，調和諸藥之功效。諸藥合力，共建健脾滲濕、清熱解毒、疏肝解郁、消食理氣、化瘀通絡、和胃降濁、生津止渴、滌脂蕩肪之功。本文運用此方熬制的湯藥灌胃給予AFLD小鼠后，從組織病理學和血清生化結果來看，湯藥處理后AFLD小鼠肝臟脂肪變性顯著減輕，高劑量藥物組尤其顯著，甚至比正常組小鼠更少的肝細胞脂肪沉積。血清ALT、AST水平作為肝臟損傷評價參數已普遍用于臨床[12]，本文發現葛花解酒滌脂湯處理可使AFLD小鼠血清ALT水平恢復正常。因此，本文結果首先證實了葛花解酒滌脂湯能夠呈劑量依賴性地顯著改善AFLD小鼠的肝臟脂肪變性及肝功能的損傷。

表2 各組小鼠肝組織PXR免疫組化評分情況

注：與正常組比較，aP< 0.01；與模型組比較，bP< 0.01。

Note. Compared with the control group,aP< 0.01; Compared with the model group,bP< 0.01.

酒精對于肝臟的危害在于肝臟是其代謝的主要場所，長期的酒精攝入經其代謝產物乙醛的毒性作用及改變的氧化還原狀態、氧化應激引起持續的肝細胞破壞以及肝臟脂質、碳水化合物、蛋白質、乳糖和尿酸代謝的改變。然而，導致這些變化的分子機制仍沒有完全了解[13,14]。近年來大量的證據表明核受體(NRs)涉及酒精誘導的肝臟損傷，改變的NRs表達水平可能決定其靶基因表達水平和對酒精性肝病的敏感性。PXR屬于NRs家族的非類固醇激素受體，參與機體內環境穩態重要調節，在機體適應環境中具有重要作用[5, 6]。綜合國內外文獻，尚未見PXR與AFLD發生相關性的報道。已知PXR定位于肝細胞質，當活化后轉移到細胞核，與RXRα形成異二聚體，結合到靶基因異生物質反應元件以增強其轉錄。PXR調控的靶基因包括Ⅰ相、Ⅱ相藥物代謝酶及一些藥物轉運體家族成員[5]。CYP3A11和CYP3A25是小鼠肝臟兩個重要的Ⅰ相異生代謝關鍵酶，為PXR所調節，在藥物代謝過程中起了重要作用[15]。CYP3A11的誘導在對乙酰氨基酚引起的肝毒性中起來重要的保護作用[16]。Lu Yuan-Fu等調查了安宮牛黃丸的長期使用對小鼠肝臟P450酶的影響，結果發現，肝組織中CYP3A11和CYP3A25表達的增強參與了安宮牛黃丸所含汞對小鼠肝毒性的保護作用[17]。考慮到CYP3A在藥物代謝中的重要作用及其與PXR的密切相關性，設想其誘導在改善酒精引起的肝臟脂肪變性等毒性病變中具有重要的影響。從本文實時熒光定量PCR和免疫組化結果來看，模型組小鼠具有同正常組小鼠相似的PXR、CYP3A11及CYP3A25 mRNA轉錄水平，經葛花解酒滌脂湯處理后，PXR與CYP3A25mRNA表達水平均顯著升高，一致地，PXR蛋白表達水平也顯著增加；各組間CYP3A11 mRNA轉錄水平沒有差異。結果提示肝臟PXR、CYP3A25表達水平的上調可能參與了葛花解酒滌脂湯對小鼠AFLD的改善作用，但其如何調節肝臟脂質代謝紊亂的機制需要進一步了解。

本文研究結果表明，葛花解酒滌脂湯具有顯著改善實驗酒精性脂肪肝小鼠肝臟脂肪沉積的作用，其作用可能與增加PXR及其調控的靶基因CYP3A25表達水平有關。本文結果為葛花解酒滌脂湯的臨床應用與推廣奠定了初步的實驗室依據，為AFLD的治療策略提供了新的思路。

[1] Day CP, James OF. Hepatic steatosis: innocent bystander or guilty party? [J]. Hepatology, 1998, 27: 1463-1466.

[2] 郭文平，王建華，王玉果. 酒精性脂肪肝中醫藥治療進展[J]. 遼寧中醫藥大學學報, 2012,14(5): 257-258.

[3] 周步高. 中醫藥干預酒精性肝損傷的實驗研究進展[J]. 時珍國醫國藥, 2014, 25(3): 709-711.

[4] 王宇光，張嫻勰，李晗，等. 以PXR受體為靶點的中藥活性成分篩選及相關藥理學研究[J]. 中國中藥雜志, 2015, 40(17): 3444-3449.

[5] Jia YZ, Viswakarma N, Reddy JK. Med1 subunit of the mediator complex in nuclear receptor-regulated energy metabolism, liver regeneration,and hepatocarcinogenesis[J]. Gene Expr, 2014, 16(2): 63-75.

[6] Gyamfi MA, Wan YJ. Pathogenesis of alcoholic liver disease: the role of nuclear receptors[J]. Exp Biol Med, 2010, 235: 547-560.

[7] Bertola A, Mathews S, KiSH, et al. Mouse model of chronic and binge ethanol feeding (the NIAAA model) [J]. Nat Protoc, 2013, 8(3): 627-637.

[8] Scharl A, Vierbuchen M,Conradt B, et al. Immunohistochemical detection of progesterone receptor in formalin-fixed and paraffin-embedded breast cancer tissue using a monoclonal antibody [J]. Arch Gynecol Obstet, 1990, 247:63-71.

[ 9] 張蓉蓉，吳大正. 野葛解酒機制的研究進展[J]. 上海中醫藥大學學報，2007, 21(2)：80-83.

[10] Rezvani AH, Overstreet DH, Perfumi M, et al. Plant derivatives in the treatment of alcohol dependency[J]. Pharmacol Biochem Behav, 2003, 75(3): 593-606.

[11] 曾明，邸曉輝. 葛根及葛花對酒精代謝的研究[J]. 醫藥論壇雜志. 2010, 31(23): 203-206.

[12] Kaplan MM. Understanding serum enzyme tests in clinical liver disease.In: Davidson CS, ed. Problems in liver diseases[M]. New York: Stratton Intercontinental Medical Book, 1979, 79-85.

[13] Lands WE. Cellular signals in alcohol-induced liver injury: a review[J]. Alcohol Clin Exp Res, 1995, 19: 928-938.

[14] Voigt MD. Alcohol in hepatocellular cancer [J]. Clin Liver Dis, 2005, 9:151-169.

[15] Thunnllel KE, Wilkinson GR. In vitro and in vivo durg interactions involving human CYP3A [J]. Annu Rev Phannacol Toxieol, 1998, 38: 389-430.

[16] Guo GL, Moffit JS, Nicol CJ, et al. Enhanced acetaminophen toxicity by activation of the pregnane X receptor[J]. Toxicol Sci. 2004, 82: 374-380.

[17] Yuan FL, Qin W, Shi XL. Evaluation of hepatotoxicity potential of cinnabar-containing An-Gong-Niu-Huang Wan, a patent traditional Chinese medicine [J]. Regul Toxicol Pharmacol, 2011, 60: 206-211.

Effect of Gehua Jiejue Dizhi decoction on the liver fatty deposition and expression of PXR in themousealcoholic fatty liver

YI Xu1, YOU Shao-wei2*, LONG Yi1, WANG Shuo-shi1, LU Dao-min1

(1. Central Laboratory, 2. Department of Gastroenterology, the Second Hospital Affiliated to Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550003, China)

Objective To explore the effect of a herbalcompound Gehua Jiejue Dizhi Decoction (GJDD) on the liver fat deposition and the expression of PXR, and the mRNA and protein expression of its target genes CYP3A11 and CYP3A25in the liver tissues of mouse models of alcoholic fatty liver. Methods Twenty-nine healthy male C57BL/6J mice were randomly divided into control group (n=5), model group (n=8), high dose GJDD group (n=8)and low dose GJDD group (n=8). The mouse model of alcoholic fatty liver was prepared according to the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIAAA) method. Then, the mice were treated with the high dose and low dose GJDD for 9 days. Serum glutamic-pyruvic transaminase (AST) and aspartate aminotransferase (AST) were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Liver fat deposition was detected by oil red O staining. Real-time RT-PCR and immunohistochemistry were performed to examine the expressions of PXR, CYP3A11 and CYP3A25. Results Compared with the model group, the liver fat deposition in the intervention groups was significantly reduced in a dose-dependent manner, with a significant increase of the expression of PXR and CYP3A25 (P< 0.01). The serum ALT level was significantly reduced in the model group (P< 0.01), while the transcriptional levels of CYP3A11 mRNA in the groups were similar (P≥ 0.05). Conclusions Gehua Jiejue Dizhi Decoction has obvious therapeutic effect on the AFLD in mice, which may be related to the activation of PXR and its target genes CYP3A25.

Alcoholic fatty liver; Gehua Jiejue Dizhi Decoction; PXR; CYP3A11; CYP3A25

貴州省中醫藥管理局中醫藥、民族醫藥科學技術課題研究 (No. Qzyy-2-14-008)。

易旭(1976-)，女，研究方向：肝病的基礎研究。

游紹偉 (1978-)，男研究方向：消化道疾病的臨床與基礎研究。E-mail：yixu2013@yeah.net

R-33

A

1671-7856(2017) 03-0036-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.007

2016-07-15