束縛-應激聯合辣素灌胃建立大鼠腹瀉型腸易激綜合征模型及評價

張 濤，方健松，黃曉燕，馬媛萍， 劉 暢，潘 鋒

(1. 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院消化科，南寧 530011；2. 廣西中醫藥大學第一附屬醫院消化科，南寧 530011；3. 浙江省中西醫結合醫院消化科，杭州 310003)

研究報告

束縛-應激聯合辣素灌胃建立大鼠腹瀉型腸易激綜合征模型及評價

張 濤1，方健松1，黃曉燕2，馬媛萍1， 劉 暢1，潘 鋒3

(1. 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院消化科，南寧 530011；2. 廣西中醫藥大學第一附屬醫院消化科，南寧 530011；3. 浙江省中西醫結合醫院消化科，杭州 310003)

目的 基于觀察大鼠癥狀學、組織病理學、內臟敏感性、肥大細胞活化、自噬、Beclin-1及Claudin-2等相關指標變化，評價束縛-應激聯合辣素灌胃建立一種新的腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，D-IBS)模型研究。方法 清潔級雄性SD大鼠40只，按體重分為正常組、模型I組、模型II組及模型III組，每組10只。模型組均采用束縛-夾尾應激聯合辣素(I組0.125%、II組0.250%、III組0.500%)灌胃制備D-IBS模型，正常組予等劑量生理鹽水灌胃處理，連續2周。分別應用Power lab儀檢測大鼠腹壁收縮次數及弓背次數變化，肥大細胞染色液(醛品紅-橙黃G法)檢測肥大細胞活化情況，采用光鏡、電鏡檢測大鼠結腸組織病理學及其自噬變化，應用免疫組化SABC法檢測大鼠結腸黏膜Beclin-1及Claudin-2表達變化。結果 模型III組大鼠全部死亡，模型II組大鼠大便次數增多，內臟敏感性閾值降低，與正常組及模型I組比較，差異有顯著性(P< 0.05)；各組大鼠結腸黏膜、黏膜上皮絨毛及腺體形態正常，未見黏膜下血管擴張及彌漫性炎癥浸潤改變；正常組除外，模型I組、II組大鼠結腸組織黏膜間質或黏膜下層可見類圓形紫紅至深紫色染色點，提示肥大細胞表達增多；模型II組大鼠結腸腸上皮細胞自噬、Beclin-1及Claudin-2表達明顯增多，與正常組及模型I組相比，差異有顯著性(P< 0.05)。結論 束縛-應激聯合0.25%辣素灌胃建立的大鼠D-IBS模型以腹瀉增多、內臟高敏感、肥大細胞表達增高、腸上皮細胞自噬增加、腸黏膜屏障破壞等表現為特點，與人IBS較為相似，該方法簡單易行，值得推廣應用。

腹瀉型腸易激綜合征；束縛-應激；辣素；內臟敏感性；自噬

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)作為消化科常見病、多發病，約占門診就診患者30%以上，耗費大量醫療資源，并嚴重影響患者生活質量而備受重視。IBS盡管病因不明，但是研究發現食物不耐受、小腸細菌過度生長、炎癥感染、精神因素及幼年不良刺激等與IBS發病密切相關，其中內臟高敏感、胃腸運動紊亂以及腦腸互動被認為是IBS的主要發病機制[1, 2]。“腦-腸-菌群軸”尤其是最近研究發現腸上皮細胞通透性增加及腸黏膜屏障破壞在IBS發病中占據重要地位[3, 4]。課題組從上述思路出發，擬通過應用辣素刺激腸道敏感性增高，導致腸道處于弱炎癥狀態，又加以束縛-應激精神刺激，聯合多因素建立IBS模型，通過檢測大鼠腸道病理生理學變化、大鼠內臟敏感性、肥大細胞活化、自噬及其相關基因Beclin-1和緊密連接蛋白Claudin-2表達等綜合評估該模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性5周齡SD大鼠40只，體重(180±20)g，購自廣西醫科大學實驗動物中心【SCXK(桂)2014-0002】。飼養于廣西中醫藥大學實驗動物中心【SYXK(桂)2014-0011】，恒溫(23±2)℃、恒濕(50±10)%、晝夜循環(12 h/12 h)條件下適應性喂養1 周后，再開始正式分組實驗。大鼠組織取材于廣西中醫藥大學實驗動物中心實驗設施內進行，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 試劑與儀器

HE染色試劑，電鏡固定液，液氮，購自廣西博仁生物試劑公司，Beclin-1、Claudin-2一抗購自美國R&D公司(貨號分別為AF5295、RDC0078)，辣素(capsaicin)購自美國Sigma公司(貨號MSDS 360376)，醛品紅-橙黃G染色液購自上海鈺森生物試劑公司，自動包埋機，萊卡自動切片機(Leica RM-2265)，倒置相差顯微鏡(德國蔡司LSM-800)，H-600透射電鏡(日本-Hitachi公司)、PowerLab儀(ML-780上海埃德儀器貿易公司)均由廣西中醫藥大學實驗中心提供。

1.3 方法

1.3.1 模型制備

清潔級雄性SD大鼠40只，適應性喂養1周，采用隨機數字表法，按體重隨機分為正常組、模型Ⅰ組、模型Ⅱ組及模型Ⅲ組，每組10只。第2周起，模型組均采用辣素灌胃聯合束縛-夾尾應激制備D-IBS模型，每天上午10點分別予模型Ⅰ組0.125%辣素、Ⅱ組0.25%辣素及Ⅲ組0.50%辣素灌胃，給藥體積為2 mL/100 g，灌胃后60 min予金屬夾夾尾，每次30 min，連續刺激，1次/日；下午3點予寬膠帶綁住前爪及后爪，每次30 min，1次/日，連續2周；正常組予等劑量生理鹽水灌胃處理，連續2周。第3周末禁食不禁水12 h，在10%水合氯醛0.33 mL/100 g腹腔麻醉處死所有大鼠，截取3～5 cm的結腸組織，沿腸系膜縱軸剪開，用生理鹽水沖洗干凈后，分瓶存儲備測。

1.3.2 指標檢測

(1)IBS大鼠結腸組織病理學檢測

采用HE染色法檢測各組大鼠結腸組織病理學改變，具體步驟嚴格按說明操作，在光鏡下觀察標本病理學改變并攝片。

(2)IBS大鼠內臟敏感性檢測

第2周末造模結束后，第3周起，參照文獻報道[5]，(1)采取直腸球囊擴張法(colorectal distension，CRD)，觀察引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的容量閾值，評估大鼠腹部回撤反射(abdominal withdraw reflex，AWR)。(2)應用Power Lab儀檢測腹壁收縮幅度，判斷大鼠腹壁緊張度，綜合評估內臟敏感性。

(3)IBS大鼠結腸肥大細胞活化檢測

采用醛品紅-橙黃G法檢測結腸組織肥大細胞陽性表達，具體步驟嚴格按試劑盒說明操作。在普通光鏡下觀察結腸的病理組織學改變情況并攝片，隨機選取5個400倍視野進行肥大細胞計數。

(4)IBS大鼠結腸上皮細胞自噬變化

采用H-600透射電鏡檢測各組大鼠結腸上皮細胞自噬變化，以及結腸黏膜組織超微結構特點，具體實驗委托廣州藍吉生物技術有限公司完成。

(5)IBS大鼠結腸Beclin-1和Claudin-2表達

采用免疫組化SABC法檢測各組大鼠結腸Beclin-1和Claudin-2表達變化(購自美國R&D公司，貨號分別為AF5295、RDC0078)，具體步驟嚴格按試劑盒說明操作，借助Image Pro-Plus 6.0軟件分析結果，以細胞呈棕褐色染色為陽性結果，對照組采用PBS代替一抗。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠一般情況變化

正常組大鼠體重呈自然生長大便正常，耗食量正常；模型III組大鼠在灌胃辣素后2 d內全部死亡(死因不詳)，模型I組大便偏爛，模型II組大鼠腹瀉較明顯，肛門較污穢，毛發稀疏，耗食量下降，拱背蜷臥、萎靡少動、喜歡扎推，但體重未見明顯下降。

2.2 IBS大鼠結腸組織病理學變化

光鏡下可觀察到各組大鼠結腸組織黏膜完整及排列正常的黏膜上皮絨毛，未見黏膜下血管擴張及彌漫性炎癥浸潤改變，腺體結構、排列正常。說明模型I組、II組大鼠結腸均不存在器質性病變，符合IBS模型表現(見圖1)。

2.3 IBS大鼠內臟敏感性檢測

2.3.1 大鼠腹部回縮反射

正常組引起大鼠腹部抬高容量閾值為(0.66±0.07) mL，背部拱起的擴張容量閾值為(1.06±0.15) mL; 模型I組腹部抬高容量閾值為(0.37±0.03) mL，背部拱起閾值為和(0.58±0.05) mL；模型II組腹部抬高容量閾值為(0.32±0.02) mL，背部拱起閾值為和(0.45±0.06) mL(見表1)。

2.3.2 大鼠腹壁緊張度

向球囊充氣前，大鼠腹壁外斜肌未見肌電活動，5 min記錄期間可記錄到較小幅度的腹壁收縮反應，考慮與大鼠身體移動有關。在0.3 mL容量時，正常組未見明顯腹壁收縮；模型I組腹壁收縮數目達(1.67±0.22)次/5 min, 差異有顯著性(P< 0.05)；模型Ⅱ組腹壁收縮數目達(2.67±0.24)次/ 5 min；0.6 mL擴張容量下,模型I組及II組腹壁收縮活動均顯著增高正常組,收縮數目達(7.57±1.30)次/5 min(P< 0.05)；1.2 mL擴張容量下各組大鼠的腹壁收縮數目差異無顯著性(P> 0.05)(見表2)。

2.4 IBS大鼠結腸肥大細胞活化比較

鏡下見正常組大鼠結腸組織為淡黃色，偶見紫紅染色點，模型I組和模型II組大鼠結腸黏膜間質和黏膜下層可見多個類圓形紫紅至深紫色染色點，尤以模型Ⅱ組較多，提示肥大細胞陽性表達增高、數目增多(見圖2)。

2.5 IBS大鼠結腸腸上皮細胞自噬比較

在透射電鏡下可見正常組存在數個自噬體，考慮為正常生理現象；模型組可見線粒體、內質網片段等損傷的細胞器膨脹變性，其周圍出現空泡狀雙層膜樣、胞漿物質結構完整的自噬囊泡，亦可見單層膜樣含有不同程度降解的胞漿成分的降解自噬囊泡，其中模型Ⅱ組較多，并且與模型Ⅰ組有差異(見圖3)。

組別Groups腹部抬高閾值/mLAbdominalelevationthreshold弓背閾值/mLCamponotusthreshold正常組controlgroup0.66±0.071.06±0.15模型Ⅰ組ModelgroupI0.37±0.03*0.58±0.05*模型Ⅱ組ModelgroupII0.32±0.02▲0.45±0.06▲

注：模型組與正常組相比，*P< 0.05；▲P< 0.05。

Note. Model group vs. the control group,*P< 0.05;▲P< 0.05.

組別Groups0.3mL0.6mL1.2mL正常組controlgroup0.49±0.112.77±0.9415.57±1.32模型Ⅰ組ModelgroupI1.67±0.22*5.27±1.10*16.37±1.40*模型Ⅱ組ModelgroupII2.75±0.24▲7.57±1.30▲19.58±1.45▲

注：模型組與正常組相比，*P< 0.05；▲P< 0.05。

Note. Model group vs. the control group,*P< 0.05;▲P< 0.05.

2.6 IBS大鼠結腸Beclin-1和Claudin-2表達分布陽性比較

Beclin-1是評估自噬活化的重要指標，Claudin-2蛋白是組成緊密連接的蛋白之一，模型組Beclin-1及Claudin-2表達(棕褐色染色為陽性)均高于正常組，其中模型II組高于I組，差異有顯著性(P<0.05)(見表3，圖4-5)。

注：A為正常組；B為模型I組；C為模型II組。大鼠結腸組織黏膜完整及排列正常的黏膜上皮絨毛，未見黏膜下血管擴張及彌漫性炎癥浸潤改變。(×20， 4 μm)圖1 各組大鼠結腸組織病理學變化Note. A: Normal group; B: Model group I; C: Model group II. The rat colonic mucosa is intact, intestinal villi are regularly arranged, and no submucosal vasodilation and diffuse inflammatory infiltration are observed.Fig.1 Histopathological changes of the colonic tissues in the rats in each group

注： A：正常組；B：模I組；C：模型II組。肥大細胞陽性染色陽性呈紫紅色。(×20， 4 μm)圖2 各組大鼠結腸肥大細胞活化Note. A: control group; B: Model group I; C: Model group II. The positive mast cells are stained purple. Fig.2 Mast cell activation in the colon tissue of rats of each group

注：A為正常組，自噬作用不明顯，細胞內可見數個自噬體；B為模型I組，自噬作用不甚明顯，細胞內可見多個自噬體；C為模型II組，自噬作用明顯，細胞內可見大量自噬體。(×10 000，bar=500 nm)圖3 各組大鼠結腸上皮細胞自噬變化Note. A: Control group. Autophagy is not obvious, several autophagosomes can be seen; B: Model group I. Autophagy is not very obvious, a number of autophagosomes can be seen; C: Model group II. Autophagy is obvious, and numerous autophagosomes can be seen in the cell. Fig.3 Changes of autophagy in the colonic epithelial cells of rats in each group

注：Beclin-1陽性染色以細胞核染呈棕褐色為主，A：正常組，黏膜層見少許棕褐色陽性染色；B：模型I組,黏膜層見較多棕褐色陽性染色，以細胞膜及細胞核為主；C：模型II組，黏膜層見較多棕褐色陽性染色，以細胞膜及細胞核為主。(×20，bar=4 μm)圖4 各組大鼠結腸Beclin-1陽性表達Note. The positive expression of Beclin-1 in cell nuclei are stained brown color. A: Control group. Sparse brown spots can be seen in the mucosal layer. B: Model group I. More positive brown-staining is present in the mucosal layer, mainly, the cell membrane and nuclei. C: Model group II. Much more positive brown-stained cell membrane and the nuclei can be seen in the mucosal layer. Fig.4 Positive expression of Beclin-1 in the colon tissue of rats in each group

注：Claudin-2 陽性染色以細胞核染呈棕褐色為主，A：正常組黏膜層見少許棕褐色陽性染色；B：模型Ⅰ組黏膜層見較多棕褐色陽性染色，以細胞膜及細胞核為主；C：模型Ⅱ組黏膜層見較多棕褐色陽性染色，以細胞膜及細胞核為主。(×20，bar=4 μm)圖5 各組大鼠結腸Claudin-2表達Note. Claudin-2 is positively stained brown in the cell nuclei. A: Control group. A few brown positive staining in the mucosal layer. B: Blank group I. More positive brown-stained cell membrane and nuclei in the colon mucosa. C: Blank group II. Much more brown positive staining to the cell membrane and the nucleus in the mucosa.Fig.5 Positive expression of Claudin-2 in the colon tissue of rats of each group

正常組Normalgroup112.41±30.25321.26±110.65模型Ⅰ組blankgroupI674.31±110.47*1042.28±140.46*模型Ⅱ組blankgroupII976.56±90.59*1135.31±167.11*

注：正常組與模型組相比，模型I組與模型II組相比，*P< 0.05。

Note. Normal group vs. the blank group, blank group I vs. the blank group II,*P<0.05.

3 討論

IBS是由多種因素共同作用引起的功能性腸道疾病，可能和結腸收縮的增強、推進運動的加大、基礎電節律的改變等有關，有文獻研究證實束縛-應激可以抑制大鼠小腸的轉運，但促進結腸活動，導致排便次數增加。晚近研究證實腸上皮細胞通透性增加及腸黏膜屏障破壞是IBS重要的病理生理變化。尤其是食物不耐受、過敏原刺激以及炎癥感染后IBS發生與上述機理密切相關。肥大細胞廣泛分布于皮膚及內臟粘膜下的微血管周圍。分泌多種細胞因子，參與免疫調節(TB細胞，APC細胞活化)。表達MHC分子，B7分子，具有APC功能。表達大量的IgE Fc 受體，釋放過敏介質，具有弱吞噬功能，和血液的嗜堿粒細胞同樣，具有強嗜堿性顆粒的組織細胞。肥大細胞在弱炎癥刺激下、食物抗原不耐受及心理應激因素作用下，可能通過大量釋放5-HT，局部改變腸黏膜通透性、刺激腸道蠕動，是破壞腸黏膜屏障的關鍵因素，通過血腦屏障后使得大腦不斷發出神經沖動指令，破壞腸道敏感性閾值，從而與腹痛、腹瀉等癥狀相關[6]。本研究結果亦發現模型組大鼠內臟敏感性增高，伴見黏膜層及黏膜下層肥大細胞活化數目增加，說明肥大細胞活化在IBS發病中可能占據重要地位。

辣素(capsaicin，CAP)是從辣椒中提取的一種天然呈辣的香草酰胺類植物堿，小劑量辣素具有保護黏膜作用；當超過適應性保護劑量達到50 mg/kg時，則可引起傳入神經纖維變性、壞死，甚至神經元細胞損傷等“去神經”作用[7]。本研究中模型I組、II組及III組分別予0.125%、0.25%、0.50% 辣素灌胃，結果模型III組大鼠全部死亡(具體死因不明，可能與辣素劑量相關，但缺乏相應證據佐證)。同時，研究發現模型I組及II組大鼠內臟敏感性增高，腹瀉明顯，肛門污穢，說明辣素具有刺激腸道蠕動，損傷神經元細胞作用。

腸上皮細胞是腸黏膜屏障的主體，它與細胞間緊密連接等是腸黏膜屏障功能的主要決定者。Claudin-2蛋白是組成緊密連接的蛋白之一，在腸炎的活動期表達活躍，可增加某些陽離子通過，被稱為孔形成(poreforming)蛋白，亦被認為是腸炎導致腹瀉的分子學機制之一[8]。當機體受到外源刺激時細胞即做出適應性反應，上調緊密連接蛋白的表達，以保護腸黏膜屏障。自噬作為機體的一種自穩機制，可以清除細胞內氧化應激產物、受損細胞器以及細菌、內毒素等物質，減少腸道過度炎癥反應及腸道損傷。有研究表明[9]，膿毒癥大鼠腸上皮細胞自噬活性較高，早期炎癥反應明顯，隨著病程進展自噬被抑制。Beclin-1是自噬體形成過程中的一個必需分子，依賴于Beclin1-PI3KC 3復合體,促進吞噬泡的聚集與組裝，參與自噬體的形成[10]。因此，Beclin-1被認為是自噬活化的重要標志。Beclin-1也是自噬重要的調節分子，可能是調控自噬/凋亡互反饋作用的交匯點，參與調節Vps-34，促進形成Beclin1-Vps34-Vps15核心復合物，誘導自噬的發生[11,12]。若自噬受抑制，細胞內氧化應激產物、受損細胞器等物質不能夠及時清除，會使細胞內環境紊亂，腸上皮細胞功能受損[13-15]。此外，研究者用傷寒沙門氏菌感染小鼠，發現自噬相關基因Atg16L1缺陷的小鼠炎癥比正常小鼠嚴重，且出現腸道細菌易位。表明自噬參與炎癥反應，可防止腸道細菌易位所致的全身感染[16，17]。本研究結果中，模型I組及II組自噬體數量及Beclin-1和Claudin-2陽性表達均比正常組增多，其中模型Ⅱ組最為明顯，與各組比較差異有顯著性(P< 0.05)。由此推測模型組大鼠存在腸上皮細胞自噬增加，腸黏膜通透性增加，腸黏膜屏障破壞的組織學變化，該變化與IBS-D發病相關。

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Establishment and evaluation of a rat model of diarrhea-predominant irritable bowel syndrome by restraint-stress combined with capsaicin administration

ZHANG Tao1, FANG Jian-song1, HUANG Xiao-yan2, MA Yuan-ping1, LIU Chang1, PAN Feng3

(1.Department of Gastroenterology, Ruikang Hospital Affiliated of Guangxi University of TCM, Nanning 530011, China; 2. Department of Gastroenterology, The First Affiliated Hospital of Guangxi University of TCM, Nanning 530011; 3. Department of Gastroenterology, The Zhejiang Hospital of Integrated Chinese medicine and Western Medicine, Hangzhou 310003)

Objective Based on the observation of the changes of symptoms, histopathology, visceral sensitivity, mast cell activation, autophagy, and Beclin-1 and Claudin-2 expression in rats, we established and evaluated a new rat model of diarrhea-predominant irritable bowel syndrome (D-IBS) induced by restraint-stress combined with capsaicin (CAP) administration. Methods Forty healthy 5-week old male Sprague Dawley (SD) rats were randomly divided into normal group, model group I, model group II and model group III, with 10 rats in each group. The D-IBS model was established by restraint-stress combined with intragastric administration of CAP (2 mL/100 g body weight, 0.125% in group I, 0.250% in group II, 0.500% in group III), tail clipping and forelimb restriction for 30 minutes every day for 2 weeks. The rats in the control group were treated with saline for 2 weeks. The number of contraction of abdominal wall and arched back were measured by Power Lab instrument. The mast cell activation was detected using aldehyde-magenta-orange G staining. Light and electron microscopic examinations were performed to detect the morphology and autophagy of colonic tissues. The expressions of Beclin-1 and Claudin-2 in the colonic mucosa were detected by streptavidin-biotin complex (SABC) immunohistochemical staining. Results All rats in the model group III died during the experiment. Compared with the control group and model group I, the stool frequency was increased and the visceral sensitivity threshold decreased in the model group II, and there were statistically significant differences between the model group II and the control and model groups I (P< 0.05). The colonic mucosa, mucosal epithelium and glands in each group showed normal morphology and there was no submucosal vasodilatation and diffuse inflammatory cell infiltration. Except for the control group, round purple-reddish staining spots were observed in the rat mucosal stroma or submucosa in the model groups I and II, indicating an increased expression of mast cells. The autophagy, expressions of Beclin-1 and Claudin-2 in the colonic epithelium were significantly increased in the model group II compared with control group and model group I (P< 0.05). Conclusions The model of D-IBS induced by restraint-stress combined with capsaicin is characterized by increased diarrhea, visceral hypersensitivity, increased mast cell expression and autophagy of intestinal epithelial cells, and disruption of the intestinal mucosal barrier. This model is simple to set up and shows similar symptoms of human irritable bowel syndrome. Therefore, it is worthy of popularization and application．

Irritable bowel syndrome; Restraint stress; Capsaicin; Visceral hypersensitivity; Autophagy

國家自然科學基金(NO:81460724);廣西自然科學基金(NO:2014GXNSFAA118212)。

張濤(1976- ), 男，博士后，主任醫師，碩士研究生導師，從事消化系疾病中西醫結合防治基礎與臨床研究。E-mail：327664246@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 03-0001-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.001

2016-07-15